別嘌醇對(duì)2型糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)細(xì)胞表型改變的保護(hù)作用與機(jī)制

張 濤 李 亞 遲雁青 劉茂東 李 英

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

糖尿病腎病(DN)作為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因，目前尚缺乏有效治療手段阻抑DN的進(jìn)展。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2型糖尿病在總體糖尿病發(fā)病人群中仍占大多數(shù)，且多合并胰島素抵抗、高尿酸血癥、高脂血癥等代謝異常。晚近越來越多的研究數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者中合并高尿酸血癥的比例明顯高于普通人群。有專家指出尿酸已成為慢性腎臟病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔1〕。以往DN基礎(chǔ)研究多集中在高糖、高脂因素對(duì)腎小球硬化的影響，而關(guān)于高尿酸血癥對(duì)DN發(fā)病及進(jìn)展影響及其干預(yù)研究卻很罕見。本研究擬以2型糖尿病小鼠作為研究對(duì)象，通過別嘌醇的干預(yù)研究，探討尿酸管理對(duì)DN腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 兔抗增殖因子(prohibitin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、E-鈣黏素(E-cadherin)多克隆抗體購自美國proterntech公司；免疫組化試劑盒購自北京中衫金橋生物有限公司；別嘌醇購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 4～6周齡雄性SPF級(jí)肥胖性2型糖尿病動(dòng)物模型C57BL/Ksj db/db小鼠12只和對(duì)照C57BL/Ksj db/m小鼠6只購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后將db/db小鼠隨機(jī)分為兩組：db/db 小鼠對(duì)照組(db/db組)、db/db小鼠+別嘌醇50 mg·kg-1·d-1治療組 (db/db + A組)。db/m小鼠作為正常對(duì)照組(db/m組)。

1.3標(biāo)本收集 各組小鼠喂養(yǎng)至12 w，處死前1 d放入代謝籠，禁食不禁水，收集小鼠24 h尿液。股靜脈取血留血清用于生化指標(biāo)檢測；處死后取部分腎皮質(zhì)置于4%多聚甲醛固定24 h，用于病理學(xué)及免疫組化檢查；其余腎組織置于干燥EP管中，放入液氮中保存，用于Western印跡檢測。

1.4血尿生化指標(biāo)檢測 血糖(Glu)、血尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血甘油三酯(TG)、24 h尿蛋白定量(Pro)用AU2700型自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.5腎組織病理學(xué)檢查 將2 μl石蠟切片分別行糖原(PAS)和膠原纖維(Masson)染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病理學(xué)改變。

1.6免疫組化檢測腎皮質(zhì)prohibitin、TGF-β、α-SMA、E-cadherin的表達(dá) 4 μl石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波熱修復(fù)抗原；0.3%過氧化氫室溫孵育20 min；正常山羊血清37℃封閉30 min；分別滴加兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗TGF-β、α-SMA、E-cadherin多克隆抗體(均按1∶200稀釋)4℃過夜；滴加羊抗兔二抗，37℃放置20 min；滴加鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)37℃放置20 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染1～3 min；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察拍片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。應(yīng)用HPIAS 2000型圖像分析系統(tǒng)半定量分析，每張切片在高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野，測量光密度值。

1.7Western印跡檢測腎皮質(zhì)prohibitin、TGF-β蛋白的表達(dá) 取100 mg腎皮質(zhì)，加入預(yù)冷RIPA蛋白裂解液置冰上充分勻漿，4℃12 000 r/min離心20 min，收集上清，二喹啉甲酸二鈉鹽(BCA)法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加封閉液稀釋的兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗TGF-β多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，β-actin(1∶2 000稀釋)4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)37℃反應(yīng)1 h，再次洗膜后加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)反應(yīng)液發(fā)光。Gel-pro分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行校正，各條帶與β-actin蛋白條帶的光密度值之比進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組生化指標(biāo)比較 db/db組、db/db+A組間Glu無明顯差異(P>0.05)，均顯著高于db/m組(P<0.05)。db/db組血漿UA、TG、BUN水平、24 h尿蛋白定量在12 w末均明顯高于db/m組(P<0.05)，db/db+A組上述指標(biāo)較同時(shí)期db/db組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標(biāo)比較

2.2腎小管間質(zhì)病理學(xué)改變 與db/m組相比，db/db組腎小管間質(zhì)增寬，腎小管基底膜增厚，胞外基質(zhì)增多，可見灶性淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤；腎小管上皮細(xì)胞可見刷狀緣脫落，部分細(xì)胞腫脹、空泡變性，甚至脫落；腎小管管腔擴(kuò)張，部分可見蛋白管型。db/db+A組上述小管間質(zhì)病變較db/db組有所改善。見圖1。

2.3各組小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA蛋白的表達(dá) 在正常對(duì)照組腎組織中，α-SMA蛋白僅表達(dá)于血管平滑肌，在腎間質(zhì)偶有表達(dá)；但在db/db組α-SMA蛋白廣泛分布于腎小管間質(zhì)區(qū)域的小管上皮和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒樣表達(dá)；db/db+A組α-SMA蛋白表達(dá)強(qiáng)度較db/db組有所減弱。正常對(duì)照組大鼠腎組織E-cadherin表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞膜，尤以細(xì)胞連接處為主，呈較強(qiáng)表達(dá)，db/db組E-cadherin的表達(dá)較db/m組顯著減少，而db/db+A組E-cadherin表達(dá)仍低于db/m組，但卻明顯高于db/db組。見圖2。

2.4各組小鼠腎組織prohibitin、TGFβ蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，在db/m組可見prohibitin蛋白的陽性表達(dá)，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，胞核內(nèi)亦有較弱表達(dá)，在腎小球固有細(xì)胞無明顯陽性表達(dá)。db/db組prohibitin蛋白表達(dá)強(qiáng)度較db/m組減弱，db/db+A組prohibitin蛋白表達(dá)仍低于db/m組，但較db/db組有所增強(qiáng)。正常對(duì)照組TGF-β蛋白在腎小球系膜區(qū)，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)、腎小管基底膜及管周毛細(xì)血管可見較弱表達(dá)，而db/db組TGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，尤以腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)變化明顯，db/db+A組較db/db組有所降低。見圖2。

Western印跡結(jié)果顯示，與db/m組相比，db/db組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)prohibitin蛋白表達(dá)減弱(P<0.01)，db/db+A組較db/db組有所增強(qiáng)(P<0.01)；TGF-β蛋白在db/m組表達(dá)很低，而db/db組較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，db/db+A組較db/db組有所下降(P<0.01)。見圖3。

圖1 各組小鼠12 w末腎組織病理變化(×400)

圖2 各組小鼠12周末腎組織prohibitin、TGF-β、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

與db/m組比較：1)P<0.01;與db/db組比較：2)P<0.01

3 討 論

DN是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，目前已成為終末期腎衰竭的最重要病因之一。既往研究認(rèn)為DN的早期病變發(fā)生在腎小球，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管間質(zhì)病變無論從發(fā)病時(shí)間或發(fā)病機(jī)制均具有獨(dú)立性，且腎小管間質(zhì)纖維化程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球硬化更為密切。腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎功能惡化快速進(jìn)展的主要原因，其機(jī)制學(xué)說眾多。有研究指出，腎臟固有細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞等，在各種損傷因素的刺激下，可向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，最終變?yōu)榉置诨|(zhì)蛋白的效應(yīng)細(xì)胞，它不僅能合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，還能分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等以旁分泌的方式影響鄰近細(xì)胞，放大其致纖維化效應(yīng)〔2〕。因此，有學(xué)者指出腎小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)在腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展中起著重要作用。

E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，是構(gòu)成腎小管上皮細(xì)胞間緊密連接的重要成分，在保持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和極性中起重要作用。當(dāng)致病因素作用于腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致E-cadherin丟失，細(xì)胞間緊密連接破壞，上皮細(xì)胞黏附特性喪失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞骨架重排，表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志蛋白如α-SMA，是TEMT的發(fā)生過程。有研究認(rèn)為α-SMA作為腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志，其表達(dá)量與腎小管間質(zhì)纖維化程度及腎功能惡化程度呈正相關(guān)〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)12 w末時(shí)糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，而肌原纖維細(xì)胞的特征性標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)升高，提示糖尿病小鼠腎臟已發(fā)生了腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。同時(shí)糖尿病小鼠腎臟病理也發(fā)生了明顯改變，再次提示腎小管間質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能是糖尿病腎間質(zhì)纖維化的基礎(chǔ)。

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶(XO)的作用下生成。無論體內(nèi)尿酸生成增多和(或)排泄減少均可導(dǎo)致高尿酸血癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥在2型糖尿病和糖代謝異常人群中的發(fā)病率明顯高于正常人群。已有橫斷面流行病學(xué)調(diào)查顯示，血尿酸在腎臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，高尿酸血癥可能是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔4〕。另外已有多項(xiàng)研究指出，高尿酸血癥可加速2型糖尿病患者DN的發(fā)生和發(fā)展〔5〕，因此早期干預(yù)高尿酸血癥對(duì)于延緩DN的進(jìn)展、防止終末期腎衰竭具有重要意義。別嘌醇是次黃嘌呤的同分異構(gòu)體，可抑制XO活性，進(jìn)而抑制尿酸生成。已獲臨床循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，應(yīng)用別嘌醇干預(yù)CKD高尿酸血癥對(duì)于延緩慢性腎損害進(jìn)展是有益和安全的。特別是針對(duì)糖尿病蛋白尿患者進(jìn)行的隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)，應(yīng)用別嘌醇干預(yù)治療數(shù)月，對(duì)于蛋白尿的控制取得了一定療效〔6〕。另有1型糖尿病模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，別嘌醇對(duì)腎臟具有保護(hù)作用〔7，8〕。本文結(jié)果提示別嘌醇可通過降低血尿酸減緩DN進(jìn)展。

腎小管上皮細(xì)胞是尿酸作用最直接的靶細(xì)胞之一，但其作用機(jī)制尚不明了。晚近研究認(rèn)為，尿酸可能通過啟動(dòng)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡等機(jī)制導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷〔9～11〕，其中涉及的具體分子途徑還有待證實(shí)。Quan等〔12〕應(yīng)用尿酸刺激腎小管上皮細(xì)胞檢測出數(shù)十種與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的蛋白變化，且這些蛋白的功能與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路關(guān)系密切，其中prohibitin可能與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。此前，黃文彥等〔13〕通過腎間質(zhì)纖維化大鼠模型尋找可能介導(dǎo)間質(zhì)纖維化的基因表達(dá)譜研究中也發(fā)現(xiàn)了prohibitin 的表達(dá)下調(diào)。Chen等〔14〕對(duì)高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞蛋白組學(xué)變化的研究中也提到了prohibitin，并指出其與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系頗為密切。

prohibitin基因是一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其表達(dá)產(chǎn)物prohibitin蛋白具有高度結(jié)構(gòu)保守型和種族同源性，主要定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞膜，并在不同部位發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用，如維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝；通過對(duì)細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抗細(xì)胞增殖和凋亡等〔15〕。已有研究顯示，prohibitin與腎小管間質(zhì)損傷有關(guān)。在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)腎間質(zhì)纖維化模型和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中，腎間質(zhì)prohibitin表達(dá)減低，且與纖維化程度呈負(fù)相關(guān)〔16，17〕。另外有研究顯示，外源性prohibitin可顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖和表型改變〔18〕。TGF-β是目前公認(rèn)的最重要的促纖維化因子，且被證實(shí)是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化最重要的細(xì)胞因子。由此可以推測TGF-β和prohibitin可能共同參與了DN腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。本研究結(jié)果也提示DN時(shí)，高尿酸血癥可能通過抑制prohibitin的表達(dá)，增加TGFβ表達(dá)誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，從而加速腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。prohibitin作為線粒體內(nèi)膜蛋白調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整是人們對(duì)該蛋白最早的認(rèn)識(shí)，prohibitin表達(dá)缺失可導(dǎo)致多種組織細(xì)胞出現(xiàn)線粒體氧化功能異常、活性氧簇(ROS)合成增多，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞因子、信號(hào)通路表達(dá)及活性異常導(dǎo)致細(xì)胞損傷。prohibitin與TGF-β的相互作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 參考文獻(xiàn)

1章友康，諶貽璞.慢性腎臟病高尿酸血癥治療的爭論和進(jìn)展〔J〕.中華腎臟病雜志，2011；21(2)：75-6.

2Simonson MS.Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int，2007；7(9)：846-54.

3Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice〔J〕.Am J Pathol，2009；175(4)：1380-8.

4Hsu CY，Iribarren C，McCulloch CE，etal.Risk factors for end-stage renal disease：25-year follow-up〔J〕.Arch Intern Med，2009；169(4)：342-50.

5Hovind P，Rossing P，Johnson RJ，etal.Serum uric acid as a new player in the development of diabetic nephropathy〔J〕.J Ren Nutr，2011；21(1)：124-7.

6Momeni A，Shahidi S，Seirafian S，etal.Effect of allopurinol in decreasing proteinuria in type 2 diabetic patients〔J〕.Iran J Kidney Dis，2010；4(2)：128-32.

7Wang C，Pan Y，Zhang QY，etal.Quercetin and allopurinol ameliorate kidney injury in STZ-treated rats with regulation of renal NLRP3 inflammasome activation and lipid accumulation〔J〕.PLoS One，2012；7(6)：e38285.

8Desco MC，Asensi M，Marquez R，etal.Xanthine oxidase is involved in free radical production in type 1 diabetes:protectionby allopurinol〔J〕.Diabetes，2002；51：1118-24.

9Sanchez-Lozada LG，Soto V，Tapia E，etal.Role of oxidative stress in the renal abnormalities induced by experimental hyperuricemia〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2008；295(4)：F1134-41.

10Zhou Y，F(xiàn)ang L，Jiang L，etal.Uric acid induces renal inflammation via activating tubular NF-kB signaling pathway〔J〕.PLoS One，2012；7(6)：e39738.

11Ryu ES，Kim MJ，Shin HS，etal.Uric acid-induced phenotypic transition of renal tubular cells as a novel mechanism of chronic kidney disease〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2013；304(5)：F471-80.

12Quan H，Peng X，Liu S，etal.Differentially expressed protein profile of renal tubule cell stimulated by elevated uric acid using SILAC coupled to LC-MS〔J〕.Cell Physiol Biochem，2011；27(1)：91-8.

13黃文彥，孫 驊，潘曉勤，等.腎間質(zhì)纖維化大鼠纖維化相關(guān)基因的初步篩查〔J〕.中華兒科雜志，2003；41(11)：855-6.

14Chen YH，Chen JY，Chen YW，etal.High glucose-induced proteome alterations in retinal pigmented epithelium cells and its possible relevance to diabetic retinopathy〔J〕.Mol Biosyst，2012；8(12)：3107-24.

15Zhou TB，Qin YH.Signaling pathways of prohibitin and its role in diseases〔J〕.J Recept Signal Transduct Res，2013；33(1)：28-36.

16Zhou TB，Qin YH，Zhou C，etal.Less expression of prohibitin is associated with increased caspase-3 expression and cell apoptosis in renal interstitial fibrosis rats〔J〕.Nephrology (Carlton)，2012；17(2)：189-96.

17陳幼發(fā).糖尿病大鼠腎小管-間質(zhì)Prohibitin的表達(dá)〔J〕.四川醫(yī)學(xué)，2009；30(5)：634-6.

18Guo W，Xu H，Chen J，etal.Prohibitin suppresses renal interstitial fibroblasts proliferation and phenotypic change induced by transforming growth factor-beta1〔J〕.Mol Cell Biochem，2007；295(1-2)：167-77.