去卵巢對大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響

周 君 何紅晨 劉慧芳 郭 華 夏 璐 陳世菊 覃渝茜 何成奇

(四川大學華西醫(yī)院康復科 四川省康復醫(yī)學重點實驗室，四川 成都 610041)

研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號傳導通路涉及骨骼發(fā)育的各個方面，激活 Wnt/β-catenin信號通路能促進成骨細胞始祖細胞增殖和分化，增加成骨細胞的活性，從而促進新骨形成，增加骨密度〔1，2〕。骨質疏松發(fā)生的分子生物學機制可能涉及Wnt/β-catenin信號通路的改變〔3，4〕。本研究觀察去卵巢對SD大鼠Wnt/β-catenin信號通路中的低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)、β-catenin mNRA表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料與設備 雙能X線骨密度測量儀(Dexa，美國)；奧林巴斯光學顯微鏡(日本)；Laica切片機(德國)；FTC2000實時熒光定量基因擴增儀(Funglyn，加拿大)；雌二醇(E2)、骨源性堿性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)酶聯(lián)免疫法試劑盒(羅氏公司，美國)；LRP5單克隆抗體(Genetex ，美國)，β-catenin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas，德國)，Taq DNA PCR反應試劑盒(Takara,中國)，其余試劑均為市售分析純。3月齡未育雌性SD大鼠20只，由四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1分組與造模 實驗動物飼養(yǎng)于四川大學華西醫(yī)院動物實驗中心，清潔級環(huán)境。適應性飼養(yǎng)1 w后，按隨機數(shù)字表法把20只實驗大鼠隨機分為正常對照組和去勢組，每組10只。參照Gregory等〔5〕對去勢組大鼠施行雙側卵巢切除術，術后每只大鼠肌肉注射青霉素4萬U，1次/d，連用3 d以預防感染。正常對照組大鼠不作任何處理。每只實驗大鼠分籠飼養(yǎng)在溫度20℃～26℃，濕度60%～70%，12 h間隔照明自由攝食。

1.2.2標本采集及處理 去勢手術后12 w，眼眶取血2 ml，室溫靜置2 h，低溫3 000 r/min離心15 min，每份分3次用移液管取上層血清約300～500 μl，分別置于3個1.5 ml EP管中，于-70℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血清E2、BALP和TRACP5b檢測 采用ELISA，嚴格按照試劑說明書操作，測定血清E2、BALP和TRACP5b水平。

1.2.4骨密度測定 雙能X線骨密度測量儀測定實驗動物左股骨骨密度。處死大鼠后，迅速取出左側股骨、剝離肌肉、生理鹽水沖洗,將股骨放在盛有深約2.5 cm的蒸餾水(用于模擬股骨周圍的軟組織)的容器中，用小動物軟件進行掃描。

1.2.5LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR檢測 參照Trizol說明書，提取大鼠右股骨中骨髓的總RNA，參照試劑盒說明書進行RT-PCR，采用β-actin作為內參。LRP5引物上游：5′-GACATTTACTGGCCCAATGG-3′，引物下游5′-CTGCCCTCCACCACCTTCT-3′，引物間片段長131 bp；β-catenin：引物上游： 5′-GGAAAGCAAGCTCATCATTCT-3′，引物下游5′-AGTGCCT GCATCCCACCA-3′，引物間片段長171 bp；β-actin：引物上游5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′，引物下游5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′，引物間片段長114 bp。PCR反應條件：①94℃ 2 min ②94℃ 20 s，55℃ 30 s，60℃ 40s，共45個循環(huán)。根據動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)(Ct值)，將原始數(shù)據(Ct值)換算為基因的相對表達量(2-ΔΔCt)用于統(tǒng)計分析。

1.2.6Western印跡檢測 取大鼠右股骨中骨髓100 mg提取蛋白， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 并將蛋白轉至硝酸纖維素膜上； 分別加入LRP5及β-catenin單克隆抗體，4℃孵育過夜；二抗常溫下孵育2 g行DAB顯色和定量分析，利用圖像分析軟件測定電泳條帶的光密度值，目的蛋白相對定量值=目的蛋白條帶光密度值/β-actin蛋白條帶光密度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件行組t檢驗。

2 結 果

2.1血清E2、BALP和TRACP5b水平 手術后12 w去勢組血清E2水平為(23.94±6.69)pg/ml，比正常對照組(42.70±12.48)pg/ml顯著降低(P<0.01)；去勢組的血清BALP水平為(108.50±7.23)U/L，比正常對照組(91.30±7.31)U/L顯著增加(P<0.01)；去勢組的血清TRACP5b水平為(12.92±2.94)U/L，比正常對照組(8.54±2.33) U/L顯著增加(P<0.01)。

2.2骨密度檢測 手術后12 w去勢組的左股骨密度 (0.242±0.020) g/cm2,比正常對照組(0.281 ±0.021)g/cm2下降13.9%(P<0.01)。

2.3RT-PCR檢測 去勢組β-catenin mRNA表達(2.49±0.84)比正常對照組(1.14±0.65)顯著增高(P<0.05)，盡管去勢組LRP5 mRNA表達(1.62±0.94)比正常對照組(1.05±0.33)高，但兩組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4Western印跡檢測 去勢組β-catenin 蛋白表達(0.31±0.13)比正常對照組(0.21±0.05)顯著增高(P<0.05)，盡管去勢組LRP5 蛋白表達(0.31±0.13)比正常對照組(0.20±0.03)高，但兩組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠骨髓中LRP5和β-catenin 蛋白的表達

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路是一種進化非常保守的信號通路，從低等生物到高等哺乳動物都廣泛存在，在生物發(fā)育、細胞轉運及細胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作用并且與腫瘤的發(fā)生密切相關〔6〕，Wnt/β-catenin信號通路還可以通過干細胞更新、促進成骨細胞始祖細胞增殖和分化、誘導成骨細胞發(fā)生、抑制成骨細胞和骨細胞凋亡等機制，促進新骨形成，增加骨密度〔2〕。經典Wnts信號通路的細胞分子包括Wnts、LRP5、β-catenin和T細胞因子/淋巴增強子結合因子(TCF/LEF)等。

LRP5是成骨細胞膜上Wnts的輔助受體；能誘導細胞內一系列的信號傳遞，在骨骼系統(tǒng)發(fā)育和維持骨量的過程中起到重要作用。在人類功能缺失的LRP5基因突變導致以骨密度降低為特點的骨質疏松癥-假神經膠質瘤綜合征的發(fā)生,而功能獲得性LRP5基因突變引起骨密度增加〔3〕。

β-catenin是一種鈣黏蛋白，它直接與鈣黏素和肌動蛋白細胞支架連接，對細胞黏附和遷移很重要，調節(jié)細胞增殖和生存，是Wnt/β-catenin 信號通路的重要組成部分〔7〕，是經典Wnts信號通路激活的必要條件〔8〕，在有Wnts信號存在時，Wnts信號通過蛋白Disheveled、軸蛋白(Axin)和Frat-1傳遞至抑制β-catenin的蛋白質復合物(APC)，Axin和糖原合成酶激酶3(GSK3)并抑制GSK3的活性，釋放β-catenin，從而β-catenin在胞質內聚集并進行核轉位，在核內，它與TCF/LEF轉錄因子相互作用，介導Wnts對基因轉錄的多種效應〔1，2，9〕。本研究結果提示去勢大鼠Wnt/β-catenin信號通路被激活，基于β-catenin在骨形成的重要作用〔8〕，推斷去卵巢促進了大鼠新骨的形成，這從去勢大鼠的血清BALP顯著增高得到證實，因為BALP反映成骨細胞活性，可以作為骨形成的生化指標〔10〕。但是去勢大鼠的骨密度總趨勢是下降的，這是因為去勢后，雌激素降低導致骨吸收增加，在本研究結果說明大鼠去勢后骨吸收增加，骨吸收大于骨形成最終導致骨密度下降。本研究結果說明去卵巢12 w后大鼠Wnt /β-catenin信號通路被激活，在去勢大鼠骨組織代謝和骨重建過程中起到重要作用。然而一項研究〔11〕發(fā)現(xiàn)大鼠去卵巢4 w和8 w后Wnt /β-catenin信號通路被抑制。究其原因，Wnt/β-catenin信號通路在去勢大鼠中的功能狀態(tài)可能與去卵巢的時間有關。

本研究提示β-catenin介導的經典Wnts信號通路被激活。Wnt /β-catenin信號通路作為促進骨形成機制的核心〔4〕，該通路所涉及的靶位或因子有望成為開發(fā)新的抗骨質疏松藥物的潛在作用位點。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕電針足三里、三陰交能促進去勢大鼠LRP5、β-catenin的表達，激活Wnt /β-catenin信號通路，從而增加骨密度。然而，由于該信號通路參與了很多基本的生命過程，如胚胎的發(fā)生、組織器官的生成等〔13，14〕，而且此通路的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關〔6，15，16〕，因而通過激活Wnt/β-catenin信號通路的機制來治療骨質疏松的靶向藥物及各種治療方法的安全性和副作用，需深入研究和全面評估。

4 參考文獻

1Bodine PV，Komm BS.Wnt signaling and osteoblastogenesis〔J〕.Rev Endocr Metab Disord，2006；7(1)：33-9.

2Hartmann C.A Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis〔J〕.Trends Cell Biol，2006;16(3)：151-8.

3Boyden LM，Mao J，Belsky J，etal.High bone density due to a mutation in LDL-receptor-related protein 5〔J〕.N Engl J Med，2002；346(20)：1513-21.

4Monroe DG，McGee-Lawrence ME，Oursler MJ，etal.Update on Wnt signaling in bone cell biology and bone disease〔J〕.Gene，2012；492(10)：1-18.

5Gregory LS，Kelly WL，Reid RC，etal.Inhibitors of cyclo-oxygenase-2 and secretory phospholipase A2 preserve bone architecture following ovariectomy in adult rats〔J〕.Bone，2006;39(1)：134-42.

6Peifer M，Polakis P.Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the nucleus〔J〕.Science，2000；287(5458)：1606-9.

7Westendorf JJ，Kahler RA，Schroeder TM.Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases〔J〕.Gene，2004；341(27)：19-39.

8Kikuchi A.Regulation of beta-catenin signaling in the Wnt pathway〔J〕. Biochem Biophys Res Commun，2000;268(2)：243-8.

9Baron R，Rawadi G，Roman-Roman S.Wnt signaling：a key regulator of bone mass〔J〕.Curr Top Dev Biol，2006；76(3):103-27.

10Han X，Xu Y，Wang J，etal.Effects of cod bone gelatin on bone metabolism and bone microarchitecture in ovariectomized rats〔J〕.Bone，2009；44(5)：942-7.

11王 燕,劉 巖，馬劍俠，等.Wnt/LRP5/β-catenin 信號通路在絕經后骨質疏松發(fā)病中的作用〔J〕.中華婦產科雜志，2011；46(10):769-72.

12Zhou J，Chen S，Guo H，etal.Electroacupuncture prevents ovariectomy-induced osteoporosis in rats：a randomised controlled trial〔J〕.Acupunct Med，2012;30(1):37-43.

13Tanaka SS，Kojima Y，Yamaguchi YL，etal.Impact of WNT signaling on tissue lineage differentiation in the early mouse embryo〔J〕.Dev Growth Differ，2011；53(7):843-56.

14Sokol SY.Maintaining embryonic stem cell pluripotency with Wnt signaling〔J〕.Development，2011；138(20)：4341-50.

15Wend P，Holland JD，Ziebold U，etal.Wnt signaling in stem and cancer stem cells〔J〕.Semin Cell Dev Biol，2010;21(8)：855-63.

16Burgess AW，F(xiàn)aux MC，Layton MJ，etal.Wnt signaling and colon tumorigenesis-a view from the periphery〔J〕.Exp Cell Res，2011；317(19)：2748-58.