Foxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

駱 贊 魏正強(qiáng) 向 相 蒙長(zhǎng)遠(yuǎn) 黎 暉 湯為學(xué)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科, 重慶 400016)

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，大腸癌的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。近幾年有研究報(bào)道，卵巢癌，肺癌，乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移均與Foxq1的高表達(dá)有關(guān)〔2～4〕。E-cadherin蛋白是上皮間質(zhì)化(EMT)的標(biāo)志之一，其表達(dá)降低與大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系〔5，6〕。目前，國(guó)內(nèi)外綜合研究二者在大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)探討Foxq1和E-cadherin蛋白在大腸癌中的相互作用及其與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1材料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科2012年3～9月行大腸癌根治術(shù)的標(biāo)本62例，每例均包括癌組織、癌旁組織(距癌組織2～5 cm)、正常大腸黏膜組織(距癌旁組織≥8 cm)。所有標(biāo)本均得到病理學(xué)證實(shí)，且術(shù)前均未行放化療，所有病例臨床及病理資料完整，其中男36例，女26例，Dukes A或B期34例，C或D期28例，年齡31～83歲，平均(58.3 ±9.43)歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑 免疫組化SP試劑盒，DAB顯影液購(gòu)自北京康為生物公司；兔抗人Foxq1多克隆抗體購(gòu)自ABGENT公司；兔抗人E-cadherin抗體購(gòu)自Protetech公司；山羊抗兔二抗，凝膠試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自貝博公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Foxq1與Ecadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá) 上述每例標(biāo)本取一部分行10%中性甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。按免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，F(xiàn)oxq1和E-cadherin一抗稀釋度為1∶100，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，用Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒為染色陽(yáng)性，根據(jù)著色強(qiáng)度和著色面積將染色強(qiáng)度分為4級(jí)：0分，細(xì)胞無(wú)顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的著色面積百分率分為5個(gè)等級(jí)：<5%為0級(jí)；5%～25%為1級(jí)；26%～50%為2級(jí)；51%～75%為3級(jí)；>75%為4級(jí)，分別取相應(yīng)分值0、1、2、3、4分。用細(xì)胞數(shù)得分和強(qiáng)度得分的和作為判斷表達(dá)結(jié)果，積分0～1分為陰性(-)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～5分為中等陽(yáng)性()，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.2.3Western印跡檢測(cè)Foxq1與E-cadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá) 收取新鮮大腸癌標(biāo)本35例保存于-80℃。按照蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明提取上述組織的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白加適量上樣緩沖液，煮沸變性5 min。分別配制5%濃縮膠和10%分離膠，恒壓40 V電泳，待Marker電泳至濃縮膠后調(diào)整電壓至80 V；待Marker電泳至距玻板底部1 cm時(shí)停止電泳。250 mA恒流轉(zhuǎn)印蛋白至0.45 μm PVDF膜上，5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h，以兔抗人Foxq1抗體和兔抗人Ecadherin抗體作為一抗(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，15 min/次。再加入羊抗兔二抗(1∶2 000)，37℃孵育90 min，洗膜同前。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)；Western印跡結(jié)果采用方差分析；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Foxq1與Ecadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá)

2.1.1免疫組織化學(xué)結(jié)果 Foxq1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，E-cadherin蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜。Foxq1在大腸癌組織中的表達(dá)水平高于大腸癌癌旁組織及正常大腸黏膜組織，在癌旁組織的表達(dá)水平高于正常組織；其中，在大腸癌組織中的表達(dá)率為75.8%(47/62)；在癌旁組織中的表達(dá)率為24.2%(15/62)，在正常大腸黏膜組織中僅為6.5%(4/62)；差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E-cadherin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于大腸癌癌旁組織及正常大腸黏膜組織，在癌旁組織的表達(dá)水平低于正常組織；其中，在大腸癌組織中的表達(dá)率為14.5%(9/62)，在癌旁組織中的表達(dá)率為30.6%(19/62)，在正常大腸黏膜組織中僅為66.1%(41/62)，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.1.2Western印跡檢測(cè)結(jié)果 Foxq1在大腸癌組織中表達(dá)水平(0.749±0.297)明顯高于正常大腸黏膜組織(0.189±0.154)及癌旁組織(0.434±0.213)，癌旁組織相對(duì)于正常黏膜組織也有所增高。E-cadherin蛋白在大腸癌組織中表達(dá)水平(0.379±0.176)明顯低于正常大腸黏膜組織(0.837±0.284)及癌旁組織(0.628±0.245)，癌旁組織相對(duì)于正常黏膜組織也有所降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.2Foxq1與E-cadherin蛋白的表達(dá)與大腸癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系 二者在大腸癌中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的分化程度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

2.3Foxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，F(xiàn)oxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.864，P<0.05；Western印跡r=-0.718，P<0.05)。

圖1 Foxq1在大腸癌組織中的表達(dá)(SP, ×200)

圖2 E-cadherin在大腸癌組織中的表達(dá)(SP, ×200)

1：正常大腸黏膜組織；2：大腸癌旁組織；3：大腸癌組織

表1 Foxq1、E-cadherin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系(n)

表2 Foxq1、E-cadherin蛋白的表達(dá)與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

Fox家族是一類龐大而功能廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程，其突變和表達(dá)異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)〔7〕。Fox家族中，有多個(gè)亞族都廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。FoxMlb在肝細(xì)胞癌〔8〕、乳腺癌〔9〕和基底細(xì)胞癌中均表達(dá)增高。研究表明，F(xiàn)oxM1上調(diào)在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中起到了十分關(guān)鍵的作用，而且FoxM1表達(dá)水平越高預(yù)后越差〔10〕。對(duì)于黑色素瘤細(xì)胞的調(diào)控，F(xiàn)oxO3a與FoxP3也起著至關(guān)重要的作用〔11，12〕。此外，還有報(bào)道FoxP1在胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤中高表達(dá)〔13〕，且與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)〔14〕。另外，F(xiàn)oxD4a、FoxIMb的表達(dá)與白血病的發(fā)生也有著十分緊密的聯(lián)系。

Foxq1是Fox基因家族的新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子之一，其基因定位于6p25.3，全長(zhǎng)2 319 bp，含有1個(gè)外顯子，編碼有403個(gè)氨基酸的蛋白。Foxq1在肺癌的發(fā)生中起到關(guān)鍵性作用，通過(guò)調(diào)控E-cadherin，使其表達(dá)下調(diào)，引起肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT化，最終導(dǎo)致肺癌發(fā)生〔4〕。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附反應(yīng)，被稱為上皮標(biāo)志物。E-cadherin也被公認(rèn)為是一種抑癌因子，其表達(dá)的缺失或下降與多種腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良有密切關(guān)系。E-cadherin蛋白在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等惡性腫瘤中均低表達(dá)或不表達(dá)。以上研究證實(shí)，由于E-cadherin蛋白的下調(diào)或缺失，可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，進(jìn)而激活β-catenin所介導(dǎo)的WNT信號(hào)通路，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移〔15，16〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)oxq1在乳腺癌中與E-cadherin蛋白的核心啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合，抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)，從而引起乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移〔5〕，提示Foxq1和E-cadherin在腫瘤發(fā)生中可能存在一定關(guān)系。

本研究顯示Foxq1在大腸癌組織中表達(dá)較高，尤其是高惡性程度的和晚期大腸癌，而在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期大腸癌組織中，F(xiàn)oxq1更是明顯表達(dá)增高。而E-cadherin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)明顯降低，尤其是高惡性程度的和晚期大腸癌，而在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期大腸癌組織中，E-cadherin表達(dá)更是明顯表達(dá)減少，提示二者不僅與大腸癌的發(fā)生發(fā)展，還與擴(kuò)散轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系。相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)oxq1與E-cadherin蛋白呈負(fù)性相關(guān)，提示二者在大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，存在直接或間接的相互調(diào)節(jié)的作用。本研究提示，可能正是由于Foxq1的增加，使E-cadherin蛋白的下調(diào)，最終導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，揭示了二者在大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的相互關(guān)系，F(xiàn)oxq1在大腸癌中處于異?；罨癄顟B(tài)，而E-cadherin蛋白在大腸癌明顯低表達(dá)，提示二者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高大腸癌的診療水平，改善預(yù)后都具有一定意義。同時(shí)，也顯示Foxq1可能為大腸癌治療的新靶點(diǎn)，可能為臨床化療新藥的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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