CDc25c在肝臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用

王 雅 趙 星 馬從乾 楊 軻

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽(yáng) 473000)

細(xì)胞周期調(diào)控異常是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)關(guān)鍵性事件，其核心成分為細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK1)。Cdc25c是CDK1的一個(gè)新家族，在G2/M期轉(zhuǎn)變中有重要的作用〔1〕。Cdc25c通過(guò)活化Cyclin B/Cdc 2復(fù)合物使細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期來(lái)對(duì)細(xì)胞起調(diào)控作用；Cdc25c作為ATM/ATR-Chk2/Chk1-Cdc25信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游底物，是G2/M期檢查點(diǎn)重要效應(yīng)因子〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，探討Cdc25c對(duì)缺血再灌注肝臟細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體重300～350 g, 購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(S組)；缺血再灌注+生理鹽水組(I/R組)；pAdEasy-Cdc25c +缺血再灌注組(C組)，每組10只。

1.2模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥鈉 (0.4～0.6 ml/100 g),劍突下行正中腹部切口3～4 cm，打開(kāi)腹腔，暴露肝門(mén)，用無(wú)損傷血管鉗夾閉門(mén)靜脈，肝動(dòng)脈造成全肝缺血30 min后，松夾恢復(fù)血流再灌注2 h。I/R組和C組在模型建立前12 h分別經(jīng)門(mén)靜脈注射生理鹽水和pAdEasy-Cdc25c。手術(shù)完畢后，取肝組織放置于液氮和甲醛中。

1.3Western印跡 取100 mg組織及1 ml的RIPA和10 μl的甲苯基磺酰氟(PMSF)放入EP管并置于超聲組織破碎儀中，之后按照RIPA裂解液說(shuō)明書(shū)提取組織蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度。取30 μg的組織總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳100 V，待蛋白至分離膠后120 V。濕轉(zhuǎn)220 mA，2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶1 000的1×鹽酸緩沖液(TBS)稀釋的一抗 Cdc25c(Santa Cruz公司兔抗多克隆抗體)及1∶1 000的1×TBS稀釋的一抗Caspase 3(Santa Cruz公司兔抗單克隆抗體)，4℃過(guò)夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBS稀釋的二抗(北京康為世紀(jì)的山羊抗兔IgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶1 000的1×TBS稀釋的一抗(北京康為世紀(jì)的兔抗鼠內(nèi)參GAPDH一抗)，4℃過(guò)夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBS稀釋的二抗(北京康為世紀(jì)公司的山羊抗兔lgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。待暗室加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑曝光，顯影。使用Quantity-one軟件計(jì)算各個(gè)樣本Cdc25c蛋白表達(dá)水平。

1.4免疫組織化學(xué)法 標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)4 μm切片，分別作蘇木素-伊紅(HE)和免疫組化(SP)染色。SP試劑盒、兔源性多克隆抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品(抗體工作比例為1∶100)。3%H2O2-甲醇阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波(750W，95℃,5 min×2次)抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，HE復(fù)染。每批染色均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，嚴(yán)格按SP試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行染色。判斷標(biāo)準(zhǔn)：①按細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺計(jì)分：0分，細(xì)胞無(wú)顯色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②.按細(xì)胞的顯色比例計(jì)分：0分，顯色細(xì)胞<10%；1分，10%～30%顯色；2分，31%～60%顯色；3分，60%以上顯色。每例積分=①×②。按積分高低分為：陰性(-)，計(jì)分為0分；弱陽(yáng)性(+),積分1～4分；強(qiáng)陽(yáng)性(),積分>4分。

1.5細(xì)胞凋亡原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL) 標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)4 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，嚴(yán)格按照TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)(In Situ cell Death Detection Kit, Fluorescein; Roche)，滴加TUNEL反應(yīng)液，溫箱孵育，滴加抗熒光淬滅劑，進(jìn)行封片。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率利用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)及Western印跡檢測(cè)Cdc25c和(Caspase)-3的表達(dá) 圖1，圖2可見(jiàn)，Caspase-3在I/R組的表達(dá)高于S組并且I/R組明顯低于C組(P<0.05)。Caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)，呈黃色或者棕黃色顆粒。Caspase-3在缺血再灌注組中的陽(yáng)性率明顯高于正常組(P<0.05)。通過(guò)上調(diào)Cdc25c基因表達(dá)，在肝臟缺血再灌注組中的Caspase-3表達(dá)明顯下降(P<0.05)。Cdc25c在S和C組明顯高于I/R組(P<0.05)。

圖1 Western印跡分析Cdc25c、Caspase 3在肝臟組織中的表達(dá)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspase 3在肝臟組織中的表達(dá)

2.2TUNEL 檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡 I/R組的凋亡比S組明顯升高(P<0.05)。而在C組凋亡較I/R明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡

3 討 論

肝臟缺血再灌注是肝部分切除及肝移植的主要制約因素之一，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。是指各種原因?qū)е赂窝髦袛嗷蛘卟蛔闶垢闻K缺血，當(dāng)恢復(fù)血供再灌注后，肝細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。凋亡是肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞死亡的主要方式〔5～7〕。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程。周期蛋白激酶是調(diào)控細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)的核心。細(xì)胞周期中必需的Cdc25基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)為Cdc25磷酸酶，它是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在正常的細(xì)胞周期中具有重要的作用。Cdc25c基因位于染色體5q31,由14個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)約2 115 bp, 其cDNA的開(kāi)放閱讀框架由1 419個(gè)核苷酸組成，編碼473個(gè)氨基酸。Cdc25c通過(guò)正反饋機(jī)制在調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂〔1〕。當(dāng)Cdc25c活性受抑制時(shí)，CDK1/周期蛋白B1復(fù)合物的活性也受將受抑制，G2期檢查點(diǎn)的總開(kāi)關(guān)處于“關(guān)閉”狀態(tài)，發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的失活，特別是在G1/S期和G2/M期檢查點(diǎn)的失活，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起重要作用，在人類(lèi)的許多腫瘤中存在Cdc25c的過(guò)量表達(dá)。通過(guò)抑制Cdc25c的表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而有效的抗腫瘤增殖〔8～10〕。

本研究顯示凋亡蛋白Caspase-3在缺血再灌注組中的表達(dá)明顯高于正常組織;干預(yù)后Caspase-3的蛋白表達(dá)明顯降低和免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。這可能由于通過(guò)ATM-Chk2途徑導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，進(jìn)展導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這和Agarwal等〔11〕的報(bào)道一致。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子，它在各種生理和病理因素刺激下，通過(guò)其家族成員的級(jí)聯(lián)放大，實(shí)施細(xì)胞的凋亡，引起細(xì)胞特征性的凋亡形態(tài)學(xué)上的改變，加重組織或者器官的功能損害。本研究提示Cdc25c具有抑制肝細(xì)胞凋亡和改善肝功能的作用，有利于預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷。然而要將之用于臨床，還要做進(jìn)一步的深入研究。

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