TLR4對人乳腺癌細胞MCF-7放射敏感性的影響

王 宏 張海鵬 盧良杰 范志民

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

Toll樣受體(TLRs)是一類重要的模式識別受體，TLRs最初被認(rèn)為是固有免疫系統(tǒng)所特有，但很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TLRs也表達于腫瘤細胞〔1,2〕。其中以TLR4的腫瘤表達最為廣泛，且表達豐度較高，因而TLR4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作用備受關(guān)注〔3,4〕。腫瘤細胞TLR4的激活可以促進細胞的增殖和凋亡抵抗〔5〕。TLR4在乳腺癌中的表達及其對乳腺腫瘤生物學(xué)行為以及對腫瘤細胞放射敏感性的研究報道甚少。因此，本研究在以往研究腫瘤細胞輻射效應(yīng)機制的基礎(chǔ)上，進一步探討TLR4對人乳腺癌細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7購自上海細胞庫，用RPMI1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%的胎牛血清及青霉素與鏈霉素各100 U/ml)、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。均用0.25%胰酶消化貼壁細胞并傳代。

1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國Clone公司；內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；TAK242購自上海佰世凱化學(xué)科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；抗小鼠TLR4抗體購自美國R&D公司；FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3照射條件及實驗分組〔6〕國產(chǎn)X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機(丹東市康嘉儀器設(shè)備有限公司)，電壓180 kV，電流18 mA，濾板0.5 mmCu+1.0 mmAl。單次照射劑量為5 Gy，源靶距60 cm，劑量率0.387 Gy/min。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞分為3組：①空白對照組：只加入PBS；②激動組(LPS組)：5 Gy照射前4 h單獨加入LPS，終濃度為1 μg/ml ；③阻滯組(TAK242組)：5 Gy照射前1 h單獨加入TAK242，終濃度為1 μg/ml。

1.4CCK-8試劑盒檢測腫瘤細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，調(diào)細胞濃度為4×104/ml，取100 μl加入96孔板中，細胞貼壁后按方法3進行實驗分組，每組設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后終止。按照試劑盒說明書用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測定其吸光度(A)值，用于表示細胞相對增殖活性，增殖活性(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.5流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化細胞，以每孔106個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細胞貼壁后按方法3進行實驗分組，每組設(shè)4復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細胞，取5×105個細胞移入離心管，1500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，懸于1×Buffer中后1 500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，棄上清，每管依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，在室溫下反應(yīng)15 min，用流式細胞儀檢測。Annexin V從FITC的綠色熒光通過FITC通道檢測；PI紅色熒光通過PI通道檢測。

1.6流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期 1×106個細胞經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液后，冰冷PBS洗滌2次，1 500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，棄上清，加入0.1 mg/ml的核糖核酸酶80 μl和5%碘化丙啶溶液150 μl，在4℃作用30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期變化，用CellQuest軟件收取細胞(每份樣品收取1×104個細胞)，結(jié)果以百分率表示。

1.7克隆形成實驗檢測細胞輻射敏感性〔7〕將不同數(shù)量的細胞分別接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，按方法3分組處理。給予不同干預(yù)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，集落形成后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加甲醇溶液固定15 min。棄固定液，加適量吉姆薩染色20 min，流水洗去染色液。倒置顯微鏡下計數(shù)各孔50個以上的集落數(shù)。按以下公式計算克隆形成率(PE,%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%，對照組克隆形成率設(shè)為100%，各組細胞存活分?jǐn)?shù)=各組克隆形成率/對照組克隆形成率。

2 結(jié) 果

2.1TLR4對受照的MCF-7細胞增殖活性的影響 MCF-7受5 Gy照射后其增殖活性明顯低于照射前(P<0.05)，經(jīng)TLR4阻斷劑TAK242處理后，其增殖活性明顯降低(P<0.05)，而用TLR4激動劑LPS處理后，其增殖活性明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 TAK242和LPS對照射前后MCF-7細胞增殖活性的影響

2.2TLR4對受照的MFC-7細胞凋亡率的影響 用TAK242阻斷TLR4后，輻射誘導(dǎo)MFC-7細胞凋亡率明顯增多，而用LPS刺激后其凋亡率明顯受抑制(P<0.05)。見表2。

表2 TAK242和LPS對照射前后MCF-7凋亡率的影響

2.3TLR4對受照的MCF-7細胞周期變化的影響 MCF-7細胞受照后G2/M期細胞顯著多于對照組(P<0.01)，G0/G1期細胞明顯減少(P<0.01)，S期細胞變化不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 TAK242和LPS對照射前后細胞周期的影響

2.4TLR4對受照的MCF-7細胞克隆形成的影響 MCF-7受5 Gy照射后其細胞存活數(shù)明顯低于照射前(P<0.01)，經(jīng)TLR4阻斷劑TAK242處理后，其細胞存活數(shù)明顯降低(P<0.01)，而用TLR4激動劑LPS處理后，其細胞存活數(shù)明顯升高(P<0.01)。見表4。

表4 TAK242和LPS對照射前后MCF-7細胞放射敏感性的影響

3 討 論

TLRs的分布十分廣泛,可以直接識別結(jié)合某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu),即病原相關(guān)分子模式,可以對不同病原相關(guān)分子模式進行識別、結(jié)合,并引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放,在天然免疫防御中起著重要作用,并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)〔8〕。目前發(fā)現(xiàn)的TLRs 家族至少已包括了12 個成員，不同的TLRs 其配體也有所不同,其中TLR4 是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖應(yīng)答的最主要受體。TLR4 幾乎分布于所有的細胞系,主要表達在參與宿主防御功能的細胞上,TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展過程相關(guān),下游信號的級聯(lián)式反應(yīng)往往會使疾病朝不良的方向轉(zhuǎn)歸〔9〕,因此臨床上研制各種阻斷或抑制TLR4 信號通路上各個節(jié)點藥物也是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。

乳腺癌是起源于乳腺腺上皮細胞的惡性腫瘤。目前已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響女性身心健康及生活質(zhì)量的首要惡性疾病之一，且威脅患者生命。亞洲范圍內(nèi)我國屬于乳腺惡性腫瘤低發(fā)病國家，但不容樂觀的是我國每年患病率同樣以非常驚人的速度在增長，由于我國國土范圍較大，區(qū)域差異性更為明顯，沿海及京、津等大中型城市的乳腺癌患者數(shù)量龐大且病死率高，城鄉(xiāng)患者相對較少但發(fā)病率增長速度加快，患病人群逐漸呈現(xiàn)出年青化趨勢，乳腺癌目前手術(shù)治療后輔助放射治療是乳腺癌的重要治療手段。理論上電離輻射能夠殺傷腫瘤細胞，因此，現(xiàn)階段臨床多采用放療的方法進行惡性腫瘤的治療。但當(dāng)放療條件一定的情況下，為了加大治療效果，繼續(xù)優(yōu)化放療射線物理劑量的分布就會受到一定的限制。Mittal等〔10〕報道，TLR4表達在輻射抵抗細胞上，其存在對腫瘤的致癌作用必不可少，同時也證明TLR4與放射敏感性密切相關(guān)。

在腫瘤的放射治療中，免疫細胞表面的TLR4信號誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)能影響宿主免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗腫瘤免疫，從而幫助腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸〔11〕。然而，腫瘤細胞在受到輻射后可釋放內(nèi)源性配體，激活TLR4信號通路，刺激NF-κB產(chǎn)生，從而促進各種細胞因子的釋放，如IL-6，血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)等，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，進而降低腫瘤的治療效果。因此，我們可以以TLR4為作用靶點選擇合適的藥物，抑制其反應(yīng)通路，降低腫瘤細胞的放射抵抗，也可以通過其他途徑增強腫瘤細胞的放射敏感性，提高腫瘤放療效果。迄今對表達在人乳腺癌細胞上TLR4的研究甚少，因此，進一步研究和闡述TLR4對乳腺癌細胞的功能和生物學(xué)特性尤為重要。

細胞表面膜受體在感應(yīng)電離輻射作用后，啟動的信號傳導(dǎo)過程可大體分為兩類，即細胞保護性通路和細胞毒性通路。前者與照射后細胞的抑制增殖有關(guān)；后者主要引起細胞凋亡〔12〕。本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用TLR4信號通路抑制劑TAK-242阻斷后能明顯抑制受照MCF-7細胞的增殖，LPS能明顯促進MCF-7細胞的增殖；用TAK242阻斷TLR4后，輻射誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡率明顯增多而用LPS刺激后其凋亡率明顯受抑制；阻斷TLR4后受照的MCF-7細胞對存活分?jǐn)?shù)降低，而刺激TLR4后受照的MCF-7細胞對存活分?jǐn)?shù)升高，說明TLR4與MCF-7細胞的放射敏感性相關(guān)。這與Mittal等〔10〕報道的表達在輻射抵抗細胞上的TLR4對腫瘤的致癌作用必不可少結(jié)果相一致，結(jié)果說明高表達TLR4的腫瘤細胞比低表達的腫瘤細胞具有輻射抗性。

文獻報道〔13〕，電離輻射誘導(dǎo)的DNA 損傷可引起細胞周期延遲，受損細胞不能通過G1 期關(guān)卡和G2 期關(guān)卡而發(fā)生G1期阻滯及G2期阻滯，得到更多修復(fù)的機會，得以進入下一細胞周期，而未修復(fù)的細胞則被清除。本實驗結(jié)果顯示，輻射可誘導(dǎo)腫瘤細胞G2期阻滯，從而有充足的時間來修復(fù)DNA損傷，有利于細胞清除，這可能是不同腫瘤細胞有不同放射敏感性的原因之一，說明阻滯TLR4可以增敏乳腺癌MCF-7 細胞, 并且可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生G2 期阻滯，其結(jié)果為臨床治療乳腺癌提供新的思考和實驗數(shù)據(jù), 為乳腺癌放射治療提供新的理論基礎(chǔ)。

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