細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬在慢性環(huán)孢素A腎毒性中的作用

羅 康 樸尚國 金英順 鄒洪斌 苗里寧 金 華 李 燦

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

慢性環(huán)孢素 A (CsA) 腎毒性以腎小管間質(zhì)帶狀纖維化為特征性病理改變，其分子發(fā)病機制不清，可能與炎性介質(zhì)、局部腎素血管緊張素系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化生長因子β1、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等〔1，2〕諸多因素相互作用有關(guān)，其中氧化應(yīng)激扮演著重要角色。長期使用CsA可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞凋亡類似，細(xì)胞自噬也將導(dǎo)致大量的腎實質(zhì)細(xì)胞死亡從而形成硬化和纖維化。最近研究〔3,4〕表明，細(xì)胞自噬參與了多種腎臟病的發(fā)病，如糖尿病腎病、單側(cè)輸尿管梗阻模型，而且細(xì)胞自噬與氧化應(yīng)激緊密相關(guān)。本研究擬利用慢性CsA腎毒性大鼠模型揭示細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬在腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)中的作用。

1 材料和方法

1.1動物模型 雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Technology, 韓國), 體重220～230 g, 喂食低鹽飼料1 w后(0.05% sodium, Teklad Premier, Madison, WI, 美國) 隨機分成兩組：對照組(vehicle,VH,n=8)：皮下注射橄欖油 (1 ml·kg-1·d-1, Sigma，美國) 4 w；CsA毒性組(n=8) 皮下注射CsA(15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma, Basel, 瑞士) 4 w。

1.2基本測定 每日給藥時測定大鼠的體重并記錄。4 w后處死大鼠前，將大鼠放入代謝籠中(Tecniplast Gazzada S. a r.l., 意大利)，留取尿液，眼眶取靜脈血，利用全自動生化分析儀(Coulter-STKS, Coulter Electronics, 美國)測定血清肌酐和血尿素氮。血CsA濃度是用單克隆抗體放射免疫分析法(Monoclonal Radioimmunoassay, Incstar, Stillwater, MN)測定。

1.3腎臟病理 處死大鼠時留取腎組織，由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定, 石蠟包埋后切片厚4 μm。脫蠟后行三色染色。TIF程度在每張切片上至少觀察20個非重疊區(qū)域，用數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)，在100倍顯微鏡下，每張切片上至少觀察非重疊20個不同區(qū)域，獲取圖像，利用 Polygon Program定量計算腎皮質(zhì)受損部位的百分比(%/0.5 mm2)。由兩個觀察者對每個樣本隨機進行盲法評分，取平均值。

1.4細(xì)胞凋亡的檢測 石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟和梯度酒精中脫水后，按 In Situ Apoptosis 測定試劑盒說明步驟，檢測細(xì)胞凋亡。每張切片上至少觀察20個非重疊區(qū)域，數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)對原位末端標(biāo)記法(TUNEL)陽性細(xì)胞進行計數(shù)，取平均值。

1.5ELISA法檢測血、尿8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG) 留取的血、尿樣在4℃，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心半徑為8.84 cm的離心機下離心5 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(Shizuoka，日本)步驟檢測。

1.6免疫印跡法 提取的腎組織用蛋白質(zhì)溶解緩沖液(10 mmol/L Tri-Cl, pH7.6; 150 mmol/L NaCl; 1% Sodium deoxycholate; 1% Triton X 100; 0.1% Sodium dodecyl sulfate; 1% aprotinin; 2 mmol/L Na3VO4; 1 μg/ml leupeptin; 1 mmol/L PMSF) 制成勻漿; 4℃下離心(1 500 r/min) 后, 取上清液測定蛋白濃度 (Bio-Rad, Hercules); 20 g 標(biāo)本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE); 電轉(zhuǎn)膜 (90 V) 2 h后, 4℃下置Bcl-2抗體于非脂牛乳中以1∶1 000 濃度孵育12～16 h; 室溫下緩沖液液洗3次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG (Amersham) 1 h; 室溫下緩沖液液洗3次,增強發(fā)光 (ECL, Amersham) 和曝光。 Bax、Caspase-3、自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ)的免疫印跡步驟與Bcl-2類似。以對照組為標(biāo)準(zhǔn) (100%) 測定條帶的光密度，用β-actin校正。

2 結(jié) 果

2.1建立慢性CsA腎毒性 與對照組(307±3.0)相比，慢性CsA毒性組大鼠(264±4.6)表現(xiàn)為體重下降、血CsA濃度增高(0±0 vs 2 670±317.9)、腎功能低下(血肌酐：38.5±3.9 vs 78.5±14.8，賧酸氮12.5±0.8 vs 27.9±38)，表明成功建立了慢性CsA腎毒性的大鼠模型。

2.2CsA對腎臟病理的影響 與對照組(圖1A、圖1C)相比，CsA毒性組(圖1B、圖1D)表現(xiàn)為明顯的帶狀纖維化形成〔(43±9)% vs (0±0)%,P<0.01〕。

圖1 兩組間腎小管間質(zhì)纖維化程度和細(xì)胞凋亡數(shù)

2.3CsA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 TUNEL染色示CsA毒性組大鼠腎小管上皮細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(38±6.5 vs 8±3.7,P<0.01)。在分子水平上，CsA致凋亡基因Bax〔(145±17)% vs (100±7)%,P<0.01〕和活化Caspase-3〔(136±13)% vs (100±5)%,P<0.01〕蛋白的表達上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl2〔(67±9)% vs (100±6)%,P<0.01〕蛋白的表達顯著下調(diào)，使Bcl-2/Bax比率減少〔(46±19)% vs (100±6)%,P<0.01〕。

2.4CsA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬 CsA腎毒性組腎中LC3-Ⅱ蛋白的表達明顯增加〔(148±12)% vs (100±11)%,P<0.01〕。

2.5CsA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷 與對照組相比，CsA毒性組血〔(223±15)% vs (116±6),P<0.01〕 和尿〔(138±12)% vs (71±7)%,P<0.01〕 氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG的水平顯著升高。

2.6相關(guān)關(guān)系 Pearson直線相關(guān)分析表明，腎小管間質(zhì)纖維化程度與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和LC3-Ⅱ蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.759,0.729,均P=0.001)。

3 討 論

盡管新的免疫抑制劑不斷問世，鈣調(diào)素抑制劑環(huán)孢素A(CsA)和他克莫司(FK506)仍為第一線強有力的免疫抑制劑，廣泛應(yīng)用于腎移植、難治性腎病綜合征、各種繼發(fā)性腎小球腎炎、促紅素抗體誘導(dǎo)的純紅細(xì)胞再生障礙性貧血。因此，揭示慢性CsA腎毒性的發(fā)病和防治機制顯得尤為重要。本實驗利用慢性CsA腎毒性大鼠模型，觀察細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是否參與 CsA誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化。結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是慢性CsA腎毒性的重要發(fā)病機制之一。

細(xì)胞凋亡在生物體的進化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)器官的發(fā)育中起著重要作用。正常生理情況下，細(xì)胞凋亡可以清除老化細(xì)胞對機體是有益的。然而在病理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究〔4～7〕表明，細(xì)胞凋亡參與了5/6腎切除模型〔5〕、單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型〔4〕、缺血再灌注損傷〔6〕、糖尿病腎病〔7〕等各種腎臟疾病的發(fā)病過程。Ortiz等〔8〕報道CsA可直接誘導(dǎo)小鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞株(MCT)細(xì)胞凋亡，呈劑量和時間依賴性。另外，CsA還可通過各種因子如血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子β1、表皮生長因子等間接地引起腎實質(zhì)細(xì)胞凋亡〔9〕。以往報道過CsA可調(diào)控凋亡基因Caspase家族成員和Bcl-2/Bax系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞凋亡與TIF呈正相關(guān)，表明細(xì)胞凋亡是引起TIF的發(fā)病機制之一〔10〕?；谝陨侠碚?，本研究檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，結(jié)果表明慢性CsA腎毒性大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，伴隨Bcl-2/Bax蛋白表達的比率減少和Caspase-3表達上調(diào)，而且TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和TIF程度呈正相關(guān)。因此，推測CsA調(diào)控Bcl-2/Bax和Caspase-3導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡，參與了慢性CsA腎毒性的TIF。

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要過程，該過程中一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體中進行降解。在新陳代謝、基因毒性、缺血、缺氧等條件下，細(xì)胞自噬可作為保護性機制。然而，過度的細(xì)胞自噬將導(dǎo)致大量的腎實質(zhì)細(xì)胞死亡從而參與腎損傷過程〔4,11〕。細(xì)胞自噬主要有三種形式，即微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。利用電子顯微鏡和免疫印跡等方法檢測細(xì)胞自噬。為揭示是否細(xì)胞自噬與CsA所致腎臟損傷有關(guān)，本實驗利用免疫印跡法檢測自噬體LC3-Ⅱ蛋白的表達。本研究結(jié)果與以往報道相一致，表明在慢性CsA腎臟損傷中，細(xì)胞自噬作為重要的發(fā)病機制參與了慢性CsA腎毒性的TIF。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)是腎小管上皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬參與各種腎臟損傷的過程〔12〕。在慢性CsA腎毒性諸多發(fā)病因素中，氧化應(yīng)激扮演著至關(guān)重要的作用。CsA可以直接導(dǎo)致腎入球動脈狹窄引起缺血、缺氧損傷，其結(jié)果是產(chǎn)生活性氧自由基和減少抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，而后者反過來引起腎小管細(xì)胞凋亡〔13〕。最近報道CsA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬緊密相關(guān)，因此抗氧化劑如左卡尼汀〔2〕或N-乙酰半胱氨酸〔13〕可明顯減少細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果表明，長期CsA治療可導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，是慢性CsA腎毒性TIF的重要原因之一。

綜上, 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬參與了慢性CsA腎毒性的發(fā)??；氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的重要因素。本研究結(jié)果為臨床上進一步認(rèn)識慢性CsA腎毒性的發(fā)病機制提供了分子理論基礎(chǔ)。

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