Cajal間質細胞在胃癌胃腸動力障礙中作用的實驗研究

胡俊華，王 琦，盧光新，楊艷果

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院消化內科，湖北 十堰 442000

胃癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第2位，死亡率仍居各種惡性腫瘤之首，每年約有934000例新發(fā)病例，其中約42%在中國［1］。臨床上發(fā)現(xiàn)大部分被診斷為胃癌的患者均有餐后上腹飽脹不適、間斷性上腹痛、反酸、噯氣、惡心、嘔吐等消化道梗阻癥狀，但影像學檢查未發(fā)現(xiàn)腸道梗阻的證據(jù)，僅提示胃腸動力下降。這些癥狀僅用腫瘤的發(fā)展不能完全解釋。

胃腸 Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是分布在胃腸道內由中胚層間充質細胞分化而來的一類細胞，被證實是胃腸道平滑肌的起搏細胞，以細胞網的形式分布于整個胃腸道，產生自發(fā)性電慢波，參與神經信號傳遞，調控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動，在胃腸道動力產生和傳導中具有重要作用［2］。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，ICC的減少及分布異常與人類很多胃腸動力障礙有關［3］。本研究通過胃癌大鼠模型，觀察胃癌大鼠幽門環(huán)形肌和下食管括約肌(lower esophageal sphincter，LES)肌條收縮功能的變化，ICC在胃體和胃竇變化，探索ICC與胃癌胃腸動力障礙的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組 裸鼠20只(湖北省實驗動物研究中心提供)2個月齡，雌雄不拘，體質量16～20 g，隨機分為正常對照組、胃癌組，每組10只。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng) 人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901，來自湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院中心實驗室。SGC-7901細胞吸盡上清液，PBS液洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5 ml，放置37℃恒溫水浴箱中5 min，振蕩后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，搖勻后分瓶，放入5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，長滿瓶底后如上法分瓶孵育，直至所需的細胞數(shù)。取清潔血球計數(shù)板、蓋玻片，用0.4%臺盼藍染液與細胞懸液混勻，從蓋玻片一側計數(shù)板凹槽加入，于低倍倒置顯微鏡下觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)。

1.3 動物模型的制作 將人胃癌SGC-7901細胞用0.2%胰酶消化成細胞懸液，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度至1.0×106個/ml，臺盼藍染色記數(shù)活細胞＞95%。用1.0 ml微量注射器將0.2 ml細胞懸液皮下接種于胃癌組裸鼠右側背部，每只接種0.2 ml。當接種部位腫瘤長至最大徑4～5 mm時確定造模成功。

1.4 胃肌條張力變化 實驗時迅速敲擊裸鼠頭部致暈，剖腹取胃，沿胃小彎剪開胃腔，沖洗胃腔。切取幽門環(huán)形肌和下食管括約肌肌條各一條(長10 mm，寬2 mm)，置于盛有Krebs液的平皿中，仔細剝離黏膜層后，在Krebs液(37℃)的肌槽中恒溫孵育，肌槽底部持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體。肌條一端用1號絲線固定在肌槽底部的有機玻璃彎鉤上，另一端固定在連于多導生理記錄儀的張力傳感器上，肌條與張力換能器相連，溫育1 h，給張力換能器1 g的前負荷。張力換能器輸入生理記錄儀，記錄肌條的機械收縮運動。

1.5 ICC的檢測 處死裸鼠，分離胃體組織，置10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟固定并切片。經恒溫箱60℃烘烤脫蠟和常規(guī)水化，經0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液pH(6.0 ±0.1)微波熱修復，PBS 洗 5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min，加入一抗c-kit抗體(兔IgG)37℃溫育1 h，PBS洗3次，5 min/次，加入酶標記二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)，37℃ 30 min，DAB顯色試劑盒顯色。每張切片光鏡下(400×)隨機選10個視野，計數(shù)棕黃色的梭形、多角形和不規(guī)則形細胞數(shù)目，每張切片測量3次，取均值，進行統(tǒng)計學處理。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0軟件包進行分析和處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，同組用藥前后電活動的比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(sNK法)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠離體幽門環(huán)形肌條及LES肌條收縮功能的測定 給張力換能器1 g的前負荷，幽門環(huán)形肌機械收縮運動記錄結果顯示，胃癌組幽門環(huán)形肌條及LES肌條肌肉張力和收縮振幅明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，見表1)。

表1 裸鼠離體幽門環(huán)形肌條及LES肌條的運動測定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

表1 裸鼠離體幽門環(huán)形肌條及LES肌條的運動測定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.01。

2.2 裸鼠胃體ICC的變化 免疫組化染色顯示正常對照組胃竇和胃體部Kit陽性細胞(棕黃色顆粒)密集地分布在環(huán)形肌層和縱形肌層之間，主要是在環(huán)形肌層內及其附近，肌間神經叢中也有密集的ICC分布，胃底肌間神經叢未見ICC分布。胃癌組Kit陽性細胞非常稀疏地分布在環(huán)形、縱形肌層間，而且無環(huán)形肌層內及附近主要分布的特點，分布密度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。胃癌組數(shù)目與正常對照組相比明顯減少，且形態(tài)異常，突起減少，并變短、變鈍。

表2 兩組ICC免疫組化半定量測定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

表2 兩組ICC免疫組化半定量測定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

注:與正常對照組相比，*P ＜0.01。

分組 例數(shù) 胃體 胃竇正常對照組10 33.46 ±3.12 21.23 ±3.21胃癌組 10 7.68 ±2.15* 12.23 ±3.54*

圖1 裸鼠胃體ICC的c-kit免疫組織化學染色(60×)A:正常對照組;B:胃癌組Fig 1 c-kit immunohistochemistry staining of ICC in nude mice(60×) A:nomal control group;B:gastric cancer group

3 討論

ICC是胃腸道平滑肌的起搏細胞，以細胞網的形式分布于整個胃腸道，產生自發(fā)性電慢波、參與神經信號傳遞，調控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動［4］。研究發(fā)現(xiàn)先天性巨結腸患兒病變段結腸壁內三種亞型的ICC數(shù)量均明顯減少甚至缺失，病變腸管喪失產生電慢波的能力，同時也有神經節(jié)細胞的減少共同導致了胃腸道動力紊亂。此外，還有很多消化道功能障礙性疾病也都存在ICC缺乏或減少，如慢性假性梗阻、賁門失遲緩癥、幽門狹窄、結腸蠕動緩慢、肛門括約肌失弛緩癥、輸入腸管癥候群、糖尿病腸功能障礙、慢傳輸型便秘及部分性腸梗阻、手術腸切除、空腸炎等均會引起ICC網絡紊亂和胃腸運動異常。因此，ICC的分布異常及功能缺失是很多胃腸功能紊亂的病理、生理學基礎。臨床上大多數(shù)胃癌患者均表現(xiàn)為上腹部疼痛外，可伴有反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐等消化道梗阻癥狀。因此，我們推測ICC在胃癌胃腸動力紊亂病理、生理機制中起著一定作用。

本實驗結果提示，胃癌組離體幽門環(huán)形肌條及LES肌條機械收縮波的振幅和頻率都較正常組明顯減少，表明發(fā)生胃腸動力障礙的胃癌大鼠胃機械收縮活動比正常對照組減弱，與我們臨床觀察到的患者早飽、惡心嘔吐、胃潴留等胃排空減弱的現(xiàn)象一致。

本研究中，組織切片c-kit免疫組化染色顯示，胃癌模型組大鼠胃體的ICC數(shù)目明顯減少，細胞突觸減少。它的減少可導致胃腸神經系統(tǒng)與平滑肌間的信息傳遞障礙，從而導致平滑肌收縮能力下降;ICC數(shù)目明顯減少，更會影響胃慢波的產生，使胃電節(jié)律紊亂，引起食管、胃蠕動緩慢，動力障礙。由此可見，胃癌ICC的異常改變與出現(xiàn)胃腸運動功能障礙有密切聯(lián)系。

總而言之，胃癌患者出現(xiàn)胃腸運動功能障礙，ICC的異常改變是其重要原因之一。保持ICC的數(shù)量和功能，延遲ICC信號網絡的破壞將有助于提高胃癌患者的生存質量。對ICC的研究將有助于找到一種輔助療法，值得進一步研究。

［1］Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］Takaki M.Gut pacemaker cells:the interstitial cells of Cajal(ICC)［J］.J Smooth Muscle Res，2003，39(5):137-161.

［3］Wang XY，Huizinga JD，Diamond J，et al.Loss of intramuscular and submuscular interstitial cells of Cajal and associated enteric nerves is related to decreased gastric emptying in streptozotocin-induced diabetes［J］.Neurogastroenterol Motil，2009，21(10):1095-e92.

［4］Ward SM，Sanders KM.Interstitial cells of Cajal:primary targets of enteric motor innervation［J］.Anat Rec，2001，262(1):125-135.