貫葉金絲桃藥材HPLC指紋圖譜研究

傳娟娟

（延安市食品藥品檢驗所，陜西 延安716000）

貫葉金絲桃為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物Hypreicum perforatum L.的干燥地上部分［1］。該屬植物分布廣泛，全世界共400余種，中國有55種、8個亞種，主要分布在西北、西南等地區(qū)［2］。生長于山坡、草叢、田埂、路邊。具有舒肝解郁、清熱利濕、消腫止痛之功效，用于情志不暢、氣滯郁悶、關(guān)節(jié)腫痛、小便不利等，還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒的特性。隨著對其在抗抑郁、抗腫瘤和艾滋病治療等方面研究的深入，貫葉金絲桃提取物越來越受到人類重視，它是近年來歐美最暢銷的植物藥之一，1997年被世界衛(wèi)生組織評定“植物藥之星”。在德國，貫葉金絲桃的研究和應(yīng)用處在世界前列，由貫葉金絲桃單味藥組成的植物藥已成為治療中、輕度抑郁癥的主導(dǎo)藥物［3］。貫葉金絲桃中主要含有貫葉金絲桃素、金絲桃素、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮甙、蘆丁等多種成分［4-5］。本實驗采用高效液相色譜法建立貫葉金絲桃的指紋圖譜分析方法，為科學(xué)控制貫葉金絲桃質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Waters高效液相系統(tǒng)（Waters 1525泵，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector）；Waters Empower色譜工作站；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

金絲桃苷對照品（批號：111521-200303，中國藥品生物制品檢定所）；貫葉金絲桃藥材，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳彥生研究員鑒定為貫葉金絲桃，樣品來源見表1。乙腈、甲醇（色譜純，TEDIA），水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil?C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；流動相：乙腈（含10%甲醇和0.2%甲酸）-水（含20%甲醇和0.2%甲酸）梯度洗脫，0～5 min時乙腈10%，5～15 min時乙腈10%→40%；15～40 min時乙腈40%→90%；40～50 min時乙腈90%→100%；50～65 min時乙腈100%；65～66 min時乙腈100%→10%；記錄時間為66 min；檢測波長為270 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫；進樣體積20μL。

2.2 對照品溶液制備及標準曲線的繪制

精密稱取金絲桃苷對照品2.4 mg，置于10 mL量瓶中，加色譜甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為金絲桃苷對照品溶液。

精密吸取金絲桃苷對照品溶液稀釋成不同濃度，各取20μL注入高效液相色譜儀測定。以峰面積值為縱坐標Y，以金絲桃苷濃度（μg/mL）為橫坐標X，繪制標準曲線見圖1），計算得線性方程：Y金絲桃苷=64963X+911082，r=0.9996，金絲桃苷進樣濃度在24.0～240.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 金絲桃苷HPLC標準曲線

2.3 供試品溶液的制備

取14批不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃藥材，粉碎過60目篩，精密稱取粉末2.0 g，加入80 mL丙酮超聲輔助提取3次，每次40 min，超聲功率200 W，將所得提取液過濾并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜甲醇洗滌定容至10 mL的棕色容量瓶，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液，在相同的條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，其色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，符合指紋圖譜的要求。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，在相同條件下分別進樣6次，其色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，符合指紋圖譜的要求。

2.6 重現(xiàn)性試驗

取同一批樣品，在相同條件下分別稱取5份，制備供試品溶液，進樣，記錄結(jié)果，其色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，符合指紋圖譜的要求。

2.7 指紋圖譜的建立

精密吸取供試品溶液20μL，進樣，將獲得的14批貫葉金絲桃藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會2004年頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》，選用1號對照藥材的色譜圖作為參照圖譜，以中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設(shè)定時間窗寬度為0.90 min，采用多點校正方法進行色譜峰的自動匹配，以3號峰作為參照峰（S）生成貫葉金絲桃的HPLC指紋圖譜13個共有峰。經(jīng)證實2號峰為蘆丁，3號峰為金絲桃苷，7號峰為槲皮素，樣品指紋圖譜疊加圖（見圖2）。并形成藥材的對照指紋圖譜（見圖3）。經(jīng)手動匹配用《EXCEL》2002軟件系統(tǒng)［6］，采用夾角余弦法（均值）計算的14批貫葉金絲桃藥材HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜（14批貫葉金絲桃藥材指紋圖譜形成的）相似度（見表2）。

圖2 貫葉金絲桃藥材指紋圖譜疊加圖

圖3 貫葉金絲桃藥材HPLC對照指紋圖譜

表2 貫葉金絲桃藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

考察了超聲提取、回流提取、索氏提取3種提取方式，其中索氏提取的效果很差，而超聲提取和回流提取色譜圖峰強度和峰數(shù)相近。用不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑，分別進行超聲提取和回流提取，其丙酮超聲提取的色譜峰數(shù)目較多，而且色譜圖整體效果不錯，故選取丙酮超聲為供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件的選擇

本實驗所用高效液相色譜條件是在參考有關(guān)文獻的基礎(chǔ)上［7-8］經(jīng)過多次優(yōu)化、篩選而確定的。曾參考張俊松［9］選用的甲醇-0.006 mol/L磷酸氫二鈉緩沖鹽（用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.5）梯度洗脫效果不理想；又參考鄭清明所用的流動相A相為80%水-19%乙腈-1%磷酸，B相為59%乙腈-40%甲醇-1%磷酸梯度洗脫，仍達不到分離的效果；后來則參考Wenkui Li［10］將其中的0.5%三氟乙酸，分別用0.5%甲酸、0.1%冰醋酸、以及0.2%甲酸來替換，結(jié)果表明0.2%甲酸的分離效果較好，所以選定流動想的配比為乙腈（含10%甲醇和0.2%甲酸）、水（含20%甲醇和0.2%甲酸）梯度洗脫，并在254 nm、270 nm、360 nm、590 nm不同的檢測波長下生成色譜圖，結(jié)果為590 nm下的峰數(shù)很少，而且峰高很低，360 nm下的基線比較平穩(wěn)，峰的分離效果也很好，但是和270 nm下相比峰數(shù)較少，254 nm下的基線漂移十分嚴重，而且峰的數(shù)目和高度幾乎和270 nm下一樣，綜合考慮270 nm下的基線相對比較平穩(wěn)，而且峰的數(shù)目和峰的高度都相對理想，而且分離效果也很好，故選擇檢測波長為270 nm。對梯度洗脫的比例時間進行摸索研究選出了最優(yōu)的洗脫程序。考察流速時發(fā)現(xiàn)流速為0.6 mL/min于流速為1.0 mL/min對峰的分離效果幾乎沒有什么變化，且流速為0.6 mL/min時，出峰時間延后，洗脫時間延長，故選用流速為1.0 mL/min。

3.3 貫葉金絲桃指紋圖譜與地域的關(guān)系

本實驗所用貫葉金絲桃藥材主要采自于陜西、四川、甘肅、安徽4省。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃藥材色譜圖中各共有峰相對保留時間對應(yīng)得非常好，但共有峰相對峰面積差別較大，有的產(chǎn)地的藥材甚至缺失某些峰，這可能與藥材的產(chǎn)地土壤條件、種植方法以及采集時間等因素有關(guān)。其中13號樣品的相似度較差，可能是因為此樣品植株從海拔兩千多米的高山草甸移栽至平原地生長，由于生長環(huán)境的變化造成化學(xué)成分及次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。移栽后貫葉金絲桃的生長形態(tài)也有所變化，由原來的草本直立生長變?yōu)橘橘胫ιL，沒有出現(xiàn)莖的分化。這表明，貫葉金絲桃中各成分的量與產(chǎn)地及海拔有密切關(guān)系。其中四川及甘肅隴西的藥材質(zhì)量較優(yōu)，可作為道地藥材。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：215.

［2］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1990：21.

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［10］Wenkui Li，John F.Fitzloff.High performance liquid chromatographic analysis of St.John's Wort with photodiode array detection［J］.Journal of Chromatography B，2001（765）：99-105.