Leptin在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

陳曉泉，黃山平，陸建榮，張 娟，丁彩霞

（陜西省腫瘤醫(yī)院病理科，陜西 西安710061）

乳腺癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占全球女性癌癥的23%，在發(fā)達(dá)國(guó)家這一比例甚至達(dá)27%，發(fā)病人數(shù)至少是其他腫瘤的兩倍［1］。Leptin是由肥胖基因（ob）編碼的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。由167個(gè)氨基酸組成，成熟后的leptin為146個(gè)氨基酸殘基，分子量約16KD［2］。leptin具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、增加細(xì)胞侵襲性、促進(jìn)血管形成和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3-4］。本研究通過(guò)檢測(cè)leptin在乳腺癌中的表達(dá)，初步探討leptin與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，為乳腺癌的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集陜西省腫瘤醫(yī)院2011-07～2012-12手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本150例，年齡28～73歲，中位年齡45.5歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）乳腺腫瘤病理學(xué)分類(lèi)，其中非特殊性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌87例，浸潤(rùn)性小葉癌41例，其他少見(jiàn)類(lèi)型乳腺癌22例；根據(jù)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，I期14例，Ⅱ期37例，Ⅲ期61例，Ⅳ期38例。另收集乳腺增生病組織30例。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌組織切片的預(yù)處理 將含有乳腺癌組織的蠟塊5μm厚度切片，65℃烤片過(guò)夜，然后經(jīng)二甲苯及100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各5 min脫蠟；90℃蒸餾水30 min，處理完畢后將玻片置于37℃蛋白酶K（0.4 g/L，2×SSC）溶液中消化10 min；室溫下于2×SSC（pH7.0）溶液中漂洗玻片2次，每次5 min；最后將玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，自然干燥玻片。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)leptin蛋白及Ki67的表達(dá)99℃抗原修復(fù)液修復(fù)40 min，室溫冷卻20 min，過(guò)氧化物酶阻斷劑作用5 min。每張切片滴加一抗50μl（抗鼠leptin，SantaCraz；抗鼠Ki67，邁新公司），室溫孵育30 min；TBST洗滌5 minx2次；室溫與二抗（辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)羊抗鼠/兔抗體，邁新）反應(yīng)30 min，TBST洗滌5minx2次；DAB染色，梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，DPX封片。

1.2.3 結(jié)果判讀leptin的著色強(qiáng)度按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定［5］不著色為0分；著色弱者為1分；著色強(qiáng)度介于弱和強(qiáng)之間者為2分；著色強(qiáng)者為3分。染色的陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：選擇5～10個(gè)高倍視野，計(jì)算1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性（0分）；5% ～25%為弱陽(yáng)性（1分）；26%～50%者為陽(yáng)性（2分）；51% ～75%者為強(qiáng)陽(yáng)性（3分）；＞75%者為極強(qiáng)陽(yáng)性（4分）。兩種評(píng)分相加，將結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)，0～1分為陰性（-）；2分為陽(yáng)性（1+）；3～4分為強(qiáng)陽(yáng)性（2+）；5～7分為極強(qiáng)陽(yáng)性（3+）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行蛋白表達(dá)狀態(tài)分析，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均認(rèn)為P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Leptin在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與Ki67間的相關(guān)性

Ki67著色部位定位于細(xì)胞核內(nèi)。leptin正常表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志。結(jié)果顯示leptin在乳腺增生病中有少量表達(dá)（20%），在本組乳腺癌組織中68例表現(xiàn)出不同程度的leptin蛋白胞漿染色（圖1），其中IHC3+的15例，IHC2+的病例26例，IHC1+的病例27例，陽(yáng)性率為45.3%，與乳腺增生病比較二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且Leptin的表達(dá)隨Ki67增殖指數(shù)的增高而陽(yáng)性率顯著升高，二者呈正相關(guān)（圖1，表1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 （IHC）leptin在乳腺癌組織細(xì)胞漿棕黃色著色，Leptin的表達(dá)與Ki67增殖指數(shù)呈正相關(guān)

表1 乳腺癌組織中Leptin的表達(dá)與Ki67增殖指數(shù)間的相關(guān)性

表2 leptin在乳腺增生病及乳腺癌中的表達(dá)

2.2 乳腺癌組織leptin表達(dá)與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的51例乳腺癌患者中l(wèi)eptin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為62.75%（32/51），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中l(wèi)eptin的陽(yáng)性表達(dá)率36.36%（36/99），表明leptin蛋白陽(yáng)性率與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；leptin的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤的體積、TNM分期及是否絕經(jīng)無(wú)相關(guān)性（表3）。

3 討論

leptin是由肥胖基因（ob）編碼的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。由167個(gè)氨基酸組成，其氨基端為由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，在分泌到血液的過(guò)程中，切除信號(hào)肽形成leptin［6］。作為蛋白質(zhì)激素，leptin的多種生物學(xué)作用是通過(guò)靶細(xì)胞膜上的leptin受體LR和相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的［7］。研究發(fā)現(xiàn)，leptin相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳輸途徑主要包括［8-10］：（1）JAK激酶/信號(hào)傳輸與轉(zhuǎn)錄活化子途徑；（2）絲裂原活化的蛋白激酶途徑；（3）磷脂酰肌醇-3激酶信號(hào)通路；以及其他可能的信號(hào)通路如C-AMP激活蛋白激酶、STAT3激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體2α等參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。leptin具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、增加細(xì)胞侵襲性、促進(jìn)血管形成和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，故推測(cè)leptin與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

表3 乳腺癌組織leptin表達(dá)與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系

在人類(lèi)正常乳腺的發(fā)育過(guò)程中，leptin是必不可少的，同時(shí)leptin與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)，leptin可使乳腺上皮細(xì)胞（HBL100細(xì)胞）和乳腺癌細(xì)胞（T47D細(xì)胞）的數(shù)量增長(zhǎng)，增長(zhǎng)率分別為50%和13.8%，其受體在兩種細(xì)胞上均有表達(dá)，說(shuō)明leptin可引起乳腺細(xì)胞的增生和乳腺癌的發(fā)生［11］。Okumura等［12］檢測(cè)了leptin對(duì)MCF-7人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞有絲分裂時(shí)間、DNA復(fù)合酶、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的水平和蛋白激酶C（PKC）的影響，結(jié)果提示高leptin血癥能夠通過(guò)加速乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織和乳癌上皮組織以及乳癌細(xì)胞中l(wèi)eptin均有表達(dá)，且在癌組織中有明顯的過(guò)表達(dá)［13］。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌及乳腺增生病組織中均有l(wèi)eptin受體表達(dá)，但乳腺癌leptin受體陽(yáng)性率（68/150，45.3%）高于乳腺增生病組織（6/30，20%），差異具有顯著性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了leptin在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，推測(cè)Leptin在乳腺癌組織的普遍性表達(dá)，會(huì)提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)leptin受體的敏感性，使乳腺癌細(xì)胞更易受leptin生物學(xué)作用的影響。Ki67是一個(gè)可靠而迅速反映惡性腫瘤增殖率的指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的增殖細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究，其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)志，F(xiàn)ilippella等認(rèn)為Ki67是預(yù)測(cè)腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)的最好指標(biāo)［14］。研究顯示在侵襲性垂體腺瘤中l(wèi)eptin與Ki67之間存在正趨勢(shì)，在大腸腺癌中l(wèi)eptin受體也與Ki67呈正相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示leptin的表達(dá)與Ki67增殖指數(shù)正相關(guān)，提示leptin在乳腺癌中的表達(dá)與其腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。與以往的報(bào)道相似［16］，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有顯著性（P＜0.05），表明Leptin與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有關(guān)。Mantzoros等［17］對(duì)絕經(jīng)前婦女進(jìn)行l(wèi)eptin與乳腺癌的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示leptin并未提高絕經(jīng)前婦女乳腺癌的發(fā)生概率。而Petridou［18］則認(rèn)為，絕經(jīng)前婦女的leptin水平與乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)。Ozet［19］等報(bào)道，乳腺癌患者血清leptin水平明顯高于對(duì)照組，絕經(jīng)前后無(wú)顯著性差異，且與疾病的發(fā)展階段無(wú)關(guān)。此外，有研究顯示leptin的表達(dá)與乳腺癌TNM分期呈正相關(guān)［20］，本研究未發(fā)現(xiàn)leptin受體的表達(dá)與乳腺癌分化程度、腫瘤分期及是否絕經(jīng)等臨床病理參數(shù)之間有相關(guān)性，可能是因?yàn)楸狙芯克占臉颖玖枯^少，今后需要增加樣本量以取得更滿意的研究結(jié)果。

總之，上述研究結(jié)果表明leptin參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，可以為我們?cè)\斷乳腺癌提供新的輔助手段，提示作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)，在腫瘤的綜合治療方案中，leptin及其受體也許能找到一席之地。

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