巢蛋白在低氧大鼠肺組織及肺動脈平滑肌細胞的表達及意義

何蘇蘇 馮加喜 林云 林玲 王良興

肺血管重構(gòu)在慢性低氧性肺動脈高壓（HPH）的發(fā)生、發(fā)展中至關(guān)重要，但其發(fā)病機制至今仍未完全闡明。巢蛋白（nestin）屬于第六類中間絲蛋白，主要出現(xiàn)在未分化具有分裂能力的細胞中，在分化成熟后，巢蛋白表達下調(diào)，在組織損傷再生過程中又呈現(xiàn)返祖性表達[1］。本研究觀察在不同低氧間期大鼠肺組織及肺血管平滑肌細胞（PASMC）巢蛋白的含量及其表達變化，旨在探討巢蛋白在HPH形成中的意義，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實驗動物及分組

二級健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，由溫州醫(yī)學院動物中心提供。按隨機排列法隨機分成正常對照組 （N 組）、低氧2周（H2w）組、低氧4周組（H4w），每組各10只。

二、主要儀器和試劑

主要儀器包括常壓低氧艙（長沙華曦電子科技有限公司），SJ-42型生理記錄儀，YL-3，4型壓力傳感器，細胞超凈工作臺 （蘇凈集團安泰公司），低氧（CO2/N2）培養(yǎng)箱（Heraeus，德國），三目倒置生物顯微鏡 （Nikon，日本），PCR儀（杭州博日科技有限公司），PCR電泳儀（北京市六一廠），凝膠成像系統(tǒng)（溫州市奧利生物醫(yī)學儀器廠），蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

主要試劑包括巢蛋白單克隆抗體（BD Pharmingen，美國），山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋），β-actin（Santa Cruz，美國），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美國），膠原酶I（Sigma，美國），Trizol總RNA抽提試劑（Invitrogen，美國），PCR 試劑盒 （Fermentas，美國），RIPA裂解液、顯影劑、定影劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

三、方 法

1.低氧動物模型制備

正常對照組大鼠于常壓、常氧條件下艙外飼養(yǎng)；H2w組、H4w組置于常壓、低氧飼養(yǎng)艙內(nèi)，O2濃度維持在9.0% ～11.0%，CO2濃度維持在5.5% ～6.5%，每日8 h，每周6 d，分別飼養(yǎng)2周、4周，艙內(nèi)用無水CaC12吸收水蒸氣，堿石灰吸收多余的CO2。

2.肺動脈平滑肌原代細胞培養(yǎng)、傳代及分組

在細胞超凈工作臺操作：取SD大鼠，腹腔麻醉后取出心肺組織，用顯微鑷分離肺動脈，去除外膜和內(nèi)膜，將中膜平滑肌用0.2%膠原酶Ⅰ消化，接種于含20%胎牛血清的DMEM的25 ml培養(yǎng)瓶，3 d后換液，約1周后細胞已基本呈融合生長，再進行傳代，行α-SM肌動蛋白免疫細胞化學染色法鑒定。本實驗采用4～6代細胞。取對數(shù)生長期細胞，相同密度接種至6孔培養(yǎng)板，待長至70%～80%時，換無血清培養(yǎng)基同步生長48 h后進行試驗。

根據(jù)培養(yǎng)方式分為以下幾組：0 h組、N 12 h組、N 24 h組、N 36 h組（常氧21%O2下分別培養(yǎng)0、12、24、36 h），H 12 h組、H 24 h組、H 36 h組（低氧5%O2下分別培養(yǎng)12、24、36 h）。

3.肺動脈平均壓和右心室質(zhì)量比、中膜厚度測定

動物分別飼養(yǎng)至規(guī)定時間后，于次日稱質(zhì)量，用5%水合氯醛（500 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，行頸正中切口，分離左頸總動脈和右頸外靜脈，采用右心導管法測定大鼠肺動脈壓力。自頸外靜脈插管至肺動脈，連接YL-4型壓力傳感器，輸入SJ-42型生理記錄儀測定mPAP。頸總動脈插管，連接YL-3型壓力傳感器，輸入SJ-42型生理記錄儀測定頸動脈平均壓（mCAP）。放血處死動物，沿房室環(huán)去除心房，沿室間隔剪下右心室，吸干分別稱取右心室（RV）、左心室+室間隔（LV+S）質(zhì)量，以RV/（LV+S）比值反映右心室質(zhì)量變化。取肺組織常溫固定于4%多聚甲醛，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅染色，每張切片選取直徑50～200μm肺細小動脈各5支，使用Image-ProPlus 6.0軟件分別測定肺動脈相對中膜厚度（PAMT）。

4.肺細小動脈巢蛋白表達免疫組織化學染色檢測

采用免疫組織化學染色法檢測。一抗為小鼠抗大鼠巢蛋白單克隆抗體，每只大鼠任取一張肺組織切片，梯度水化，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，兔血清封閉，一抗、二抗、SABC、DAB顯色，陽性結(jié)果呈棕黃色。每張切片隨機選取直徑50～200μm肺細小動脈各5支，Image-ProPlus 6.0軟件檢測動脈管壁平均吸光度作為巢蛋白的相對含量。

5.肺組織中巢蛋白mRNA表達水平檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測。根據(jù)已知大鼠巢蛋白基因序列為模板，經(jīng)primer premier5.0軟件設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄PCR引物，巢蛋白上游引物5'-CACCTCAAGATGTCCCTTAGTC-3'，巢蛋白下游引物5'-AAGTAGGGTGGTGAGGGTTG-3'，目的產(chǎn)物532 bp；內(nèi)參引物：內(nèi)參照GAPDH上游引物5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'，GAPDH 下 游 引 物 5'-GTCTTCTGAGTGG CAGTGAT-3'，目的產(chǎn)物為288 bp。取各組肺組織各1 g，提取總RNA，具體操作參照試劑盒的說明書，紫外分光光度法測定RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄生成模板DNA后進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5 min；95℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。

6.肺組織及肺平滑肌中巢蛋白蛋白表達水平檢測

采用蛋白免疫印跡檢測。取各組肺組織1 g及收集各組細胞各約1×107個。RIPA裂解提取組織和細胞總蛋白，常規(guī)制備8%和12%雙層分離膠及4%濃縮膠，樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。依次5%脫脂奶粉封閉、小鼠抗大鼠巢蛋白單克隆抗體孵育、HRP標記二抗孵育、ECL發(fā)光、顯影。以小鼠抗大鼠β-肌動蛋白單克隆抗體為內(nèi)參照。

四、統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗，多組間比較采用方差分析，用Homogeneity of Variances Test進行方差齊性檢驗。多組樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。巢蛋白蛋白表達水平與時間的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）和PAMT的變化

H2w、H4w組大鼠的mPAP、RV/（LV+S）、PAMT均高于N組 （P＜0.05），H4w組mPAP、RV/（LV+S）、PAMT高于H2w組（P＜0.05）；3組間mCAP比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）和PAMT的變化n=10）

表1 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）和PAMT的變化n=10）

注：與N組比較，a P＜0.05，b P＜0.01；與H4w組比較，c P＜0.05

組 別 mPAP（mmHg）mCAP（mmHg）RV/（LV+S）（100%）PAMT（μm）9.9±0.8 122±4 27.5±1.7 17.4±3.1 H2w組 14.4±0.8bc 124±3 31.5±1.2bc 27.6±2.9bc H4w組 16.5±0.8b 127±5 34.9±1.4b 36.2±3.3b F值 182.1 3.591 64.18 413.7 P值N組＜0.001 0.414 ＜0.001 ＜0.001

二、各組大鼠光鏡下肺血管形態(tài)學變化

光鏡下可見，N組肺細小動脈管壁均勻一致，平滑肌層未見明顯增厚；低氧使管腔明顯狹窄，中膜平滑肌層細胞增生肥大，H4w組較H2w組更為明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠肺小動脈蘇木素-伊紅染色結(jié)果（×200）

三、各組肺細小動脈巢蛋白表達變化

免疫組織化學染色顯示，H2w、H4w組肺動脈管壁巢蛋白表達量較N組增加，且H4w組增加較H2w組明顯，見圖2。

圖2 各組大鼠肺小動脈免疫組織化學染色（×200）

四、各組肺組織中巢蛋白mRNA表達

肺組織中，N組巢蛋白mRNA表達水平低，而H2w、H4w組表達均明顯增高，與N組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），且H4w組的表達較H2w組高（P＜0.05），見圖3，表2。

圖3 各組大鼠肺組織勻漿巢蛋白mRNA的表達

表2 各組大鼠肺細小動脈巢蛋白表達變化s，n=10）

表2 各組大鼠肺細小動脈巢蛋白表達變化s，n=10）

注：與N 組 比 較，t H2w組 =2.357，a P＜0.05，t H2w組 =2.921，b P＜0.01；與H4w組比較，t H2w組=2.240，c P＜0.05

images/BZ_40_1283_2779_2242_2854.png0.108±0.047 H2w組 0.124±0.025ac 3.929 0.032 H4w組 0.137±0.031 N組b

五、肺組織及肺動脈平滑肌細胞巢蛋白蛋白表達

肺組織中，N組巢蛋白的蛋白表達水平較低，低氧組蛋白表達較N組增加（P＜0.01），且H4w組較H2w組上調(diào)巢蛋白蛋白表達（P＜0.01），見圖4。

肺動脈平滑肌細胞中，N組各時間段巢蛋白的蛋白表達水平雖較0 h組有所增加，但不明顯（P均＞0.05），平滑肌細胞在低氧培養(yǎng)12、24、36 h后巢蛋白蛋白表達較0 h組增加（t分別為3.068、12.271、26.077，P均＜0.01），且較同一時間段的N組增加（t分別為3.158、7.896、20.529，P＜0.01），見圖5。肺動脈平滑肌細胞中的巢蛋白的蛋白含量，隨著低氧培養(yǎng)的時間的增加而逐漸增高（r=0.991，P＜0.01）。

圖4 各組肺組織巢蛋白的蛋白表達變化

圖5 各組肺動脈平滑肌細胞巢蛋白的蛋白表達變化

討 論

肺動脈高壓是由肺血管收縮、肺血管重建以及原位血栓形成共同引起。低氧導致肺血管平滑肌細胞表型改變，并從中膜遷移至內(nèi)膜大量增殖，使肺動脈中膜增厚，血管內(nèi)腔變窄，在肺血管重建中發(fā)揮重要作用[2］。本研究顯示，隨著低氧時間的增加，大鼠mPAP、RV/（LV+S）及PAMT逐漸增加，蘇木素-伊紅染色后可見低氧導致肺動脈中膜平滑肌層細胞增生肥大，管腔明顯狹窄。

巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白，首先于1985年，Hockfield和Mckay在胚胎大鼠脊髓組織提取物中作為制備單克隆抗體Rat-401的抗原時被發(fā)現(xiàn)，其可通過連接微絲和微管參與細胞骨架的形成。

Suguta等[3］在不穩(wěn)定心絞痛患者的冠脈斑塊星狀平滑肌細胞中檢測到大量的巢蛋白，提示巢蛋白在冠狀動脈粥樣斑塊的形成過程中起著關(guān)鍵作用。Oikawa等[4］發(fā)現(xiàn)巢蛋白在處于生長發(fā)育中的動脈中表達，但當動脈發(fā)育成熟后巢蛋白即消失，且呈時間部位依賴性，但在球囊損傷后的頸動脈新內(nèi)膜重新出現(xiàn)，提示在血管重構(gòu)時巢蛋白可能起到重要作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)缺氧可刺激鼠胚軟骨組織巢蛋白的表達[5］。巢蛋白在肺內(nèi)研究鮮少，僅有少許報道在人體的胎肺及成人肺支氣管細胞中檢測到巢蛋白的表達[6］。本實驗通過免疫組織化學染色檢查可見，在正常肺組織動脈中僅見少許巢蛋白表達，慢性低氧大鼠肺細小動脈巢蛋白的表達顯著高于N組，且較長低氧培養(yǎng)比短時間低氧表達有所增高。

本實驗同時采用了逆轉(zhuǎn)錄PCR和蛋白印跡分析肺組織巢蛋白的表達水平探討巢蛋白與肺動脈高壓的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常大鼠肺組織中巢蛋白mRNA及蛋白表達水平均很低，而低氧各組巢蛋白的mRNA及蛋白表達水平均高于N組。

有文獻報道，離體培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞在血清刺激下通過依賴表皮生長因子觸發(fā)的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶途徑可重新大量表達巢蛋白，可能與其細胞表型的改變有關(guān)[4，7-8］。Sakairi等[9］用低氧干預(yù)離體培養(yǎng)的LLC-PK1細胞后，發(fā)現(xiàn)伴隨著細胞表型的改變，低氧誘導細胞巢蛋白蛋白表達增加。本研究通過低氧干預(yù)培養(yǎng)的離體大鼠肺動脈平滑肌細胞，采用蛋白印跡分析各組細胞巢蛋白的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)相同時間時，低氧在蛋白水平上調(diào)了巢蛋白表達。

有研究用小片段RNAi技術(shù)在抗Thy1腎炎小鼠模型中，沉默巢蛋白表達，顯著減弱因腎小球系膜損傷引起的腎小球系膜細胞增殖[10］，提示巢蛋白可以促進細胞的增殖。Huang等[11］用RNA干擾技術(shù)抑制血管平滑肌細胞巢蛋白的表達，促進過氧化氫介導的血管平滑肌細胞凋亡，提示巢蛋白具有抗凋亡作用。結(jié)合本研究結(jié)果，提示慢性低氧可誘導大鼠肺動脈巢蛋白及其基因表達增高，與慢性肺動脈高壓形成密切相關(guān)，但其具體作用機制尚待進一步研究探討。

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