蛋白酶及其活性檢測方法研究進展

徐 滕，孫梅好，陳果果，倪逸琳，張 靜

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

蛋白酶（Protease）又稱蛋白水解酶[1]。自1905年10月 1日，Levene[2]發(fā)表了《The Cleavage Products of Proteoses》，至今，對蛋白酶的研究僅僅經(jīng)過100多年，已有35萬篇與蛋白酶相關(guān)的文獻。蛋白酶參與DNA遺傳信息的傳遞、血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)、干細胞動員、止血、凝血、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞自噬、衰老、壞死和細胞凋亡等生物過程[3-4]。許多蛋白酶已經(jīng)成為疾病預(yù)測及診斷的生物標志，在藥物治療方面為我們提供了新的方向。

1 蛋白酶的種類

蛋白酶最初分為：內(nèi)肽酶切割蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鍵和外肽酶（氨肽酶和羧肽酶）切割其相應(yīng)的底物NH2和COOH末端[5]。根據(jù)其催化機理，蛋白酶又可以分為2類：一類利用活化的水分子作為親核試劑攻擊底物中的肽鍵，催化底物反應(yīng)，包含了天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶；另一類蛋白酶是利用其活性位點的氨基酸殘基作為親核試劑，包括半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸[6]。不同種類的蛋白酶又可以根據(jù)其氨基酸序列以及蛋白三維結(jié)構(gòu)進一步分為不同的蛋白酶家族。

1.1 半胱氨酸蛋白酶

其也被稱為硫醇蛋白酶，是降解蛋白質(zhì)的酶。在一些水果中，半胱氨酸蛋白酶比較常見，如木瓜、菠蘿、無花果和獼猴桃等。目前，已知幾十個不同植物科的膠乳含有半胱氨酸蛋白酶[7]。

半胱氨酸蛋白酶在生理和發(fā)育過程中發(fā)揮多方面的作用。在植物中，它們參與信號傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫。在人類中，它們參與細胞的衰老和凋亡、MHCII類免疫應(yīng)答、激素原的加工和細胞外基質(zhì)重塑等。在炎癥疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化）中，半胱氨酸蛋白酶可加速膠原蛋白和彈性蛋白的降解[8]。

1.2 絲氨酸蛋白酶

絲氨酸蛋白酶（或絲氨酸內(nèi)肽酶）是裂解肽鍵的蛋白質(zhì)酶，其中，活性中心的親和氨基酸為絲氨酸[9-10]。它們是在真核生物和原核生物中普遍存在的酶。根據(jù)絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)可以分為兩大類：胰凝乳蛋白酶類和枯草桿菌蛋白酶類[11]。在人類中，它們參與各種生理過程，包括消化、免疫應(yīng)答、凝血和繁殖等。

捕食線蟲性真菌分泌胞外蛋白酶固定線蟲并降解其體壁，從而發(fā)揮殺線蟲效應(yīng)，絲氨酸蛋白酶便是其中之一[12]。

1.3 金屬蛋白酶

金屬蛋白酶是一類催化反應(yīng)時需要金屬離子參與的蛋白酶，大多數(shù)金屬蛋白酶需要鋅離子參與，有一些蛋白酶需要鈷離子參與。EDTA能夠螯合二價陽離子，抑制金屬蛋白酶的活性[13]。

1.4 天門冬氨酸蛋白酶

天門冬氨酸蛋白酶催化蛋白降解時需要用天門冬氨酸殘基。在一般情況下，它們在活性位點有2個高度保守天門冬氨酸殘基，并且其在酸性pH值時具有最高活性。幾乎所有已知的天門冬氨酸蛋白酶都能被胃蛋白酶抑制劑所抑制。在脊椎動物、真菌和逆轉(zhuǎn)錄病毒中，天門冬氨酸肽酶均已被鑒定[14]。

1.5 蘇氨酸蛋白酶

蘇氨酸蛋白酶活性中心具蘇氨酸殘基，此酶的原型是蛋白酶體的催化亞基。蘇氨酸蛋白酶使用其N-末端的蘇氨酸仲醇作為親核基團進行催化[15-16]。

2 蛋白酶的功能及其應(yīng)用

在進化的初始階段，蛋白酶有可能僅僅作為蛋白質(zhì)分解所必須的一種破壞性酶，并參與原始生物中氨基酸的生產(chǎn)。在很長一段時期內(nèi)，蛋白酶研究主要集中在其原始功能蛋白質(zhì)的分解[5]。然而，此類酶除了具有這些非特異性降解的功能外，更能夠作為一種分子工具，催化高度特異性蛋白水解，產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這些發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了蛋白酶研究的一個新時代[17]。

蛋白水解酶具有多種生理功能，從宏觀的蛋白質(zhì)消化到微觀的調(diào)節(jié)過程。酶原的激活、血液凝固和纖維蛋白凝塊的裂解、蛋白激素前體和活性肽的釋放、跨膜蛋白的分泌等都需要蛋白酶的參與。另有研究表明，蛋白酶在植物的生長、發(fā)育、死亡及其對周圍環(huán)境的適應(yīng)中也同樣具有重要的生物學(xué)功能。許多致病微生物的繁殖需要蛋白酶的參與，有些蛋白酶還作為微生物的毒力因子。

正是由于蛋白酶在細胞的各種行為、在生物的生存以及死亡中扮演著重要的角色。疾病能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)水解系統(tǒng)發(fā)生變化，如癌癥、神經(jīng)變性疾病、炎癥和心血管疾病等。許多蛋白酶已經(jīng)成為潛在的藥物靶點和疾病診斷以及預(yù)測的生物標志。

蛋白酶制劑目前已在飼料生產(chǎn)加工中得到應(yīng)用。在家畜養(yǎng)殖過程中，部分蛋白飼料未能充分利用而直接被排出體外，其原因可能是由于其自身內(nèi)源酶分泌不足與飼料中含大量抗營養(yǎng)因子，從而影響其蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[18]。在飼料中添加蛋白酶制劑能促進畜禽對養(yǎng)分的消化、吸收，提高飼料的利用率，促進生長。蛋白酶制劑也可用于動物生產(chǎn)中，對提高其生產(chǎn)性能起到很大的作用[19]。

蛋白酶也是生物技術(shù)研究的重要工具，在表達蛋白時，有時需要與特定的親和性標簽融合表達、純化目的蛋白，但標簽可能會影響目的蛋白的活性，需要用蛋白酶去除標簽。目前，在比較常用的蛋白酶中，3C蛋白酶在低溫下也具有良好的活性，使其應(yīng)用時更有前景[20-21]。

3 蛋白酶活性的檢測方法

蛋白酶的生化分析類型可分為2類：均相檢測和分離型檢測。在均相檢測中，無需進行進一步的加工，即可在反應(yīng)混合液中檢測到底物信號轉(zhuǎn)變；在分離型檢測中，酶反應(yīng)停止后反應(yīng)混合液中的產(chǎn)物以及殘余的底物需要經(jīng)過進一步的分離定量來檢測反應(yīng)的進行。

一般蛋白酶切反應(yīng)底物是易斷裂的酰胺鍵，底物可以是蛋白質(zhì)也可以是合成的多肽。圖1顯示，底物氨基酸在易斷裂的氨基端編號為P1，P2和P3等（稱為P位點），最接近易斷裂位置的氨基酸殘基編號為P1。羧基端的命名與氨基端一致，該殘基被編號為 P1'，P2'，P3'等（稱為 P'點）。不同的蛋白酶其易斷裂酰胺鍵兩側(cè)的氨基酸數(shù)目不同：氨肽酶的底物在易斷裂酰胺鍵位點的氨基端只有1，2個氨基酸殘基；羧肽酶的易斷裂位點的羧基端也只有1，2個氨基酸殘基；但是在內(nèi)肽酶底物的易斷裂位點兩側(cè)有數(shù)個氨基酸殘基。

3.1 均相檢測蛋白酶活性

均相檢測無需將溶液中的產(chǎn)物和底物分離，它依賴于底物的物理性改變，通過熒光或發(fā)色基團等報告基團標記，底物的物理性變化表現(xiàn)為熒光或者比色度的改變。

許多熒光標記技術(shù)已被應(yīng)用于蛋白酶活性的檢測。目前，檢測蛋白酶活性應(yīng)用廣泛的有4種方法：化學(xué)淬滅染料、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）、雙標簽熒光淬滅、熒光偏振強度。

3.1.1 通過化學(xué)淬滅染料測定蛋白酶活性 熒光染料通過共價鍵連接到多肽羧基端作為蛋白酶活性的指示劑，蛋白酶識別多肽并與其形成復(fù)合物，切割底物的酰胺鍵。熒光染料連接到多肽的羧基端，熒光染料熒光淬滅，蛋白酶識別多肽序列進行切割時，熒光染料與多肽分離，熒光強度急劇上升（圖2）。在一定范圍內(nèi)，被釋放熒光染料的強度與酶活性成線性關(guān)系。其中，最常用的熒光染料是香豆素衍生物和若丹明[22-23]。

氨基酸P'位點的C端需連接熒光基團，且需保持蛋白酶識別位點周圍氨基酸序列的完整性。特別是內(nèi)肽酶等需嚴格保持斷裂位點周圍序列的完整性，對底物修飾應(yīng)避免在P'位點相鄰的位置。

3.1.2 通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）測定蛋白酶活性 FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）即熒光共振能量轉(zhuǎn)移：當2個發(fā)射熒光的物質(zhì)距離比較接近時，一個熒光分子能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移到另外相近的一個熒光分子?；谝陨弦?，F(xiàn)RET被應(yīng)用到蛋白酶活性檢測中，此方法中，2種熒光基團連接到多肽鏈的兩端，一個為供體，另一個為受體。供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長重疊，當用激發(fā)光激發(fā)供體時，供體發(fā)射出的熒光被受體接收并發(fā)射出特定波長的熒光。選擇供體和受體位置時，不能影響蛋白酶識別序列的完整性，并且它們之間距離足夠近，能產(chǎn)生FRET信號。隨著肽鏈的斷裂，熒光基團相互分離，F(xiàn)RET信號減弱（圖3）。

3.1.3 通過雙標簽熒光淬滅機理測定蛋白酶活性

在某些條件下需要檢測上升信號，基于這種需求，雙標簽熒光淬滅被應(yīng)用到檢測蛋白酶活性中[24]。供體熒光激發(fā)波譜與受體吸收波譜的最大波峰重疊，受體與供體距離足夠近，供體的發(fā)射光被重新吸收，導(dǎo)致熒光信號強度較低。蛋白酶將肽鏈斷裂，供體與受體分離，受體不能接受供體發(fā)射的熒光，導(dǎo)致觀察到的供體熒光強度增加。在這種情況下，供體僅作為呈現(xiàn)酶活性的報告基團，而受體僅僅作為供體的熒光淬滅劑（圖4）。

DeNEDDylases和DeSUMOlyases的酶活性應(yīng)用此種方法檢測[25-26]。DeNEDDylases和DeSUMOlyases通過切割NEDD8或者SUMO與被修飾蛋白之間的連接鍵，催化一些蛋白質(zhì)的去NEDD化修飾和去SUMO化修飾。

3.1.4 通過檢測熒光偏振（FP）強度測定蛋白酶活性 熒光偏振分析[27]有時也被稱作消化熒光偏振法。蛋白質(zhì)或者多肽被標記一個或多個熒光染料，底物體積將會變得較大，轉(zhuǎn)動變慢，通常會表現(xiàn)出較大的偏振信號。蛋白酶切割底物時，大型底物轉(zhuǎn)化為小的片段，小分子的轉(zhuǎn)動速度快，測量的熒光偏振程度較低（圖5）。

FP分析可用于測定競爭結(jié)合試驗。在這種情況下，所監(jiān)測的偏振信號來自于熒光標記的多肽底物。當多肽底物與較大蛋白質(zhì)相互作用而形成較大的復(fù)合子時，而小分子競爭物與蛋白質(zhì)結(jié)合阻止熒光標記的多肽與蛋白質(zhì)結(jié)合，多肽則會保持較高的轉(zhuǎn)動速度，呈現(xiàn)較低的熒光偏振信號。因此，當FP信號下降時，表明存在小分子能與標記肽競爭結(jié)合蛋白酶的底物結(jié)合位點。

值得一提的是，F(xiàn)P測量的熒光偏振與非熒光偏振比值僅僅是在一定的濃度范圍內(nèi)準確可靠，超過這一濃度范圍檢測敏感度會下降，從而限制該方法的應(yīng)用。

3.2 基于分離的活性檢測試驗

基于標記肽的檢測方式為檢測蛋白酶活性提供了便利的條件，它不僅適合于大文庫的篩選，也能記錄酶活反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)。動力學(xué)數(shù)據(jù)則進一步反映了復(fù)合物與靶點相互作用的具體信息（如抑制劑的時間依賴性，與靶點的解離常數(shù)等）。

然而，某些情況下底物不能被標記，或者標記的底物不能滿足測定要求，一種基于分離的檢測方法應(yīng)運而生。將酶活反應(yīng)停止于預(yù)先確定的線性范圍內(nèi)，底物的轉(zhuǎn)化量必須達到檢測的水平，將反應(yīng)混合液中的組分分開，分別測量。反應(yīng)液中的底物與產(chǎn)物通常通過高效液相色譜法等方法分離，然后通過柱層析或者質(zhì)譜檢測，液相色譜和質(zhì)譜原理已經(jīng)很明確，且具有高通量檢測平臺。例如，一種多微型通道高效液相系統(tǒng)可以同時運行多個微型柱，其適用于篩選較大復(fù)合物集合。此外，BIOCIUSLife Sciences已開發(fā)RapidFireTM高通量質(zhì)譜系統(tǒng)，其可以以每秒一個樣品的速度運行[28-29]。均相檢測不適合檢測蛋白酶活性時，可以采用該方法初步測定蛋白酶酶活。

4 改進型蛋白酶活性的測定方法

近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，多種新型的蛋白酶活性檢測方法得到應(yīng)用。其中一種是利用石墨烯氧化物作為新型平臺來檢測蛋白酶活性：利用其熒光淬滅特性以及結(jié)合多肽的能力，石墨烯氧化物與熒光標記多肽分別作為FRET中的供體及受體。標記的多肽結(jié)合到石墨烯氧化物基底上，而蛋白酶切割多肽使得熒光染料與石墨烯氧化物分離，促使熒光強度增強。

電化學(xué)方法也可以用來檢測蛋白酶活性，該方法是利用高聚陰離子或者陽離子作為底物，具體為富含精氨酸的魚精蛋白和多硫酸戊聚糖（PPS，一種高度硫酸化多糖）的配合物。由于蛋白酶將精蛋白切割為較小的片段，產(chǎn)生游離的PPS，通過聚陰離子敏感膜電極檢測其電位變化。因此，游離的PPS產(chǎn)生速率與溶液中蛋白酶活性成正比[30]。這種方法可在10 min內(nèi)檢測蛋白酶活性，與之前檢測魚精蛋白消耗的方法[31-32]相比毫不遜色。

在過去的10 a中，已有許多蛋白酶活性檢測方法的報道，但其中大部分方法都是費時的、不切實際的。因此，開發(fā)簡單、快速、靈敏、高通量的常規(guī)測定方法勢在必行。

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