神經(jīng)生長因子在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)和意義

李 倩 許翠萍 楊 梅 孫園園

山西醫(yī)科大學(xué)(030001)

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)是目前研究最為廣泛的神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，是一類對神經(jīng)元發(fā)育、存活、凋亡起重要作用的蛋白質(zhì)。NGF在機(jī)體組織損傷和炎性反應(yīng)中可調(diào)控免疫細(xì)胞活性，參與炎性反應(yīng)，發(fā)揮促炎或抗炎效應(yīng)。近年來，多項(xiàng)研究表明炎癥性腸病(IBD)患者腸道神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)結(jié)構(gòu)和功能表現(xiàn)異常，提示ENS也參與了IBD發(fā)病過程[1]。NGF是ENS中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，國外多項(xiàng)研究[2-3]表明，NGF及其受體在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)腸黏膜組織中表達(dá)上調(diào)，但對NGF在UC患者血清中的表達(dá)少見報(bào)道。本研究通過檢測NGF在UC患者腸黏膜和血清中的表達(dá)，旨在探討NGF在UC發(fā)病機(jī)制中的作用及其意義。

材料與方法

一、標(biāo)本獲取

納入2011年1月-2013年5月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化科確診的UC患者40例，其中男21例，平均年齡(50.24±14.01)歲，女19例，平均年齡(42.63±14.36)歲；UC呈輕度13例、中度19例、重度8例；累及直腸10例、直腸乙狀結(jié)腸14例、全結(jié)腸16例。UC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見(2007年，濟(jì)南)”[4]。選取同時(shí)期單純性結(jié)腸息肉患者10例作為對照組。所有患者行結(jié)腸鏡檢查，在病變處和距息肉5 cm以上正常腸道黏膜處取樣。對20例UC患者和10例同期健康體檢者采集靜脈血2 mL，靜置30 min，3 000×g離心10 min分離血清，于-80 ℃冰箱保存待測。

二、方法

腸黏膜標(biāo)本行免疫組化染色檢測NGF，PBS為一抗陰性對照，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、5% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；枸櫞酸(pH 6.0)高溫(120 ℃)高壓熱修復(fù)2 min；4 ℃過夜；二抗為辣根過氧化物酶，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片。血標(biāo)本以ELISA法檢測NGF，檢測步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

免疫組化染色結(jié)果判斷：隨機(jī)觀察5～10個(gè)高倍鏡視野，陽性細(xì)胞數(shù)<25%為(+)，25%～49%為(++)，≥50%為(+++)。采用積分綜合計(jì)量，計(jì)算公式為(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3，總數(shù)值<1.0為(+)，1.0～1.5為(++)，>1.5為(+++)，每張切片至少隨機(jī)觀察5～10個(gè)高倍視野，使用Image-J軟件測量灰度值，取其平均值，比較陽性表達(dá)強(qiáng)度，灰度值越小，陽性表達(dá)越強(qiáng)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組腸黏膜組織中的NGF表達(dá)

UC組腸黏膜組織中NGF陽性表達(dá)較多，NGF主要表達(dá)于黏膜上皮、腺體上皮以及炎性細(xì)胞的胞質(zhì)中，而對照組腸黏膜組織中NGF陽性表達(dá)較UC組明顯減少(188.71±5.92對167.04±12.22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

二、輕、中、重度UC患者腸黏膜組織中NGF的表達(dá)

輕度(176.94±11.28)與中度(162.27±10.57)和重度(162.26±7.45)UC患者腸黏膜組織NGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中度與重度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。NGF表達(dá)與UC嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(rs=0.505,P<0.05)。

A：對照組；B：輕度UC；C：中度UC；D：重度UC

三、不同病變部位腸黏膜組織NGF的表達(dá)

UC患者中，病變位于直腸、直腸乙狀結(jié)腸、全結(jié)腸的腸黏膜組織中NGF的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)，提示NGF表達(dá)與病變部位無關(guān)。

表1 UC組不同病變部位間腸黏膜組織NGF的表達(dá)

四、兩組血清NGF表達(dá)

UC組血清NGF表達(dá)較對照組升高[(23.24±14.20) pg/mL對(17.47±2.47) pg/mL]，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。20例UC患者腸黏膜組織和血清中NGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.529,P<0.05)。

討 論

對UC發(fā)病機(jī)制的研究一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而重點(diǎn)主要集中在免疫異常、感染、環(huán)境以及精神因素等方面。Johansson等[3，5]通過對接受外科手術(shù)的UC患者腸道標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，NGF在腸道神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中均有表達(dá)，主要存在于黏膜上皮、腺體上皮以及炎性細(xì)胞胞質(zhì)中，且黏膜層炎性細(xì)胞浸潤越多，NGF表達(dá)越強(qiáng)，說明NGF與炎性反應(yīng)有關(guān)。現(xiàn)已知腫瘤壞死因子-α(TNF-α)參與了UC的發(fā)病過程。對轉(zhuǎn)基因小鼠的關(guān)節(jié)炎模型研究[2]顯示，NGF可以通過增加前列腺素E2(PGE2)的合成和分泌下調(diào)TNF-α。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，NGF可活化肥大細(xì)胞(Mc)，并誘導(dǎo)Mc合成、分泌NGF，NGF既可通過自分泌方式作用于Mc，又可通過旁分泌方式促進(jìn)神經(jīng)元和軸突再生，而神經(jīng)再生可能成為UC黏膜愈合的關(guān)鍵因素[3]。因此，NGF可能在UC組患者病情轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮以抗炎為主的綜合性保護(hù)作用。另外，小鼠結(jié)腸炎模型顯示，抗-NGF治療可加重腸道炎癥的嚴(yán)重程度[6]。本研究中，NGF在UC腸黏膜組織中的表達(dá)較正常組明顯增高，而且中、重度UC患者腸黏膜NGF表達(dá)高于輕度患者，可見炎癥程度越重，NGF表達(dá)也越強(qiáng)。NGF在UC腸道黏膜組織中表達(dá)增高可能與UC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，且與UC疾病程度呈正相關(guān)，中、重度UC中NGF表達(dá)明顯增多可能是一種保護(hù)作用，但本研究發(fā)現(xiàn)UC中NGF的保護(hù)作用與病變部位無關(guān)，這是由于UC時(shí)ENS的結(jié)構(gòu)和功能改變無部位特異性。何榮國等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者血清NGF水平明顯高于正常對照人群，并與焦慮/抑郁的評分呈正相關(guān)，說明慢性蕁麻疹患者的情緒對內(nèi)源性NGF的表達(dá)有一定程度的影響。很多學(xué)者認(rèn)為，UC是一種身心疾病，某些心理精神因素，如緊張、焦慮、抑郁等可誘發(fā)或加重病情，UC患者如果處于焦慮/抑郁中，可能導(dǎo)致自主神經(jīng)功能紊亂，引起內(nèi)源性NGF水平升高，血清NGF水平可能成為反映UC病情活動的有效指標(biāo)之一。本研究中，NGF在UC患者血清中的表達(dá)與其在腸黏膜組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，測定其血清水平也許有助于疾病程度的判斷。此外，NGF在UC組血清中的表達(dá)濃度較對照組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)。

綜上所述，NGF在UC中表達(dá)增高可能與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也進(jìn)一步說明神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌在UC發(fā)病中的作用，但神經(jīng)系統(tǒng)在UC中的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其在UC中究竟發(fā)揮怎樣的作用有待繼續(xù)研究。將外源性NGF用于UC的實(shí)驗(yàn)研究，可能有助于為UC的治療提供新思路。

1 張德奎，甘華田. 重視研究腸道神經(jīng)系統(tǒng)在炎癥性腸病發(fā)病中作用[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16 (28): 3200-3203.

2 Johansson M, Norrg?rd O, Forsgren S. Are neurotrophins important in ulcerative colitis?[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1107: 290-299.

3 Johansson M, Norrg?rd O, Forsgren S. Study of expression patterns and levels of neurotrophins and neurotrophin receptors in ulcerative colitis[J]. Inflamm Bowel Dis, 2007, 13 (4): 398-409.

4 歐陽欽，胡品津，錢家鳴，等. 對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見(2007年，濟(jì)南)[J]. 中華消化雜志, 2007, 27 (8): 545-550.

5 Johansson M, J?nsson M, Norrg?rd O, et al. New aspects concerning ulcerative colitis and colonic carcinoma: analysis of levels of neuropeptides, neurotrophins, and TNFalpha/TNF receptor in plasma and mucosa in parallel with histological evaluation of the intestine[J]. Inflamm Bowel Dis, 2008, 10 (14): 1331-1340.

6 Reinshagen M, Rohm H, Steinkamp M, et al. Protective role of neurotrophins in experimental in inflammation of the rat gut[J].Gastroenterology, 2000, 119 (2): 368-376.

7 何榮國，田華，張錫寶，等. 慢性蕁麻疹患者負(fù)性情緒與血清神經(jīng)生長因子水平的相關(guān)性研究[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2007, 23 (9): 783-784.