補充n-3多不飽和脂肪酸對高脂飲食大鼠腸道菌群及門靜脈血內(nèi)毒素的影響

曹戰(zhàn)江，于健春，康維明，馬志強，葉 欣，田樹波

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京100730

肥胖癥目前已成為世界范圍內(nèi)重要的公共健康問題，在中國，超重和肥胖人口分別超過22.8%和7.1%［1］。肥胖主要為脂肪在體內(nèi)異常蓄積，可引起糖尿病、動脈硬化、脂肪肝、高脂血癥等代謝綜合征，影響人們的健康與壽命［2］。已知人體消化道內(nèi)存在數(shù)量約1014的微生物，其基因組數(shù)量是人體的150倍以上［3］。研究顯示，腸道菌群可影響宿主健康，有肥胖傾向的人腸道內(nèi)菌群更易從食物中吸收熱量，導致肥胖相關菌群在腸道中熱量吸收效率增加，引起相關慢性炎癥，提高腸道通透性，造成內(nèi)毒素入血，并最終導致肥胖及代謝綜合征［4-6］。n-3多不飽和脂肪酸 (n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3PUFAs)是一種多不飽和脂肪酸，其第1個不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第3位，具有心血管保護和免疫調(diào)節(jié)等作用。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖癥患者血漿及脂肪組織n-3 PUFAs含量減少［7］，補充-3PUFAs可減輕肥胖患者的體重，改善代謝綜合征［8］，但其對腸道菌群是否有調(diào)節(jié)作用目前尚不十分清楚。本研究觀察了補充n-3PUFAs對高脂飲食大鼠腸道菌群及門靜脈血內(nèi)毒素水平的影響，探討了其改善肥胖及代謝綜合征的可能機制。

材料和方法

實驗動物及分組無特定病原體級4周齡雄性SD大鼠40只 (4只實驗中灌胃未成功，于后期剔除)，體重 (102.1±6.1)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為分為普通飲食組(CD，n=10)、高脂飲食組 (HFD，n=10)、普通飲食+n-3PUFAs組 (CD+n-3PUFAs，n=7)、高脂飲食+n-3PUFAs組 (HFD+n-3PUFAs，n=9)4組，其中，CD+n-3PUFAs組與HFD+n-3PUFAs組每天經(jīng)胃給予n-3PUFAs［主要為二十二碳六烯酸 (docosahexenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid，EPA)，按照1000 mg/(kg·d)給予，由北京百慧生化制藥公司提供］，其他兩組則給予相應量的生理鹽水。4組大鼠均喂養(yǎng)10周，每周記錄體重變化。

飼料配方及供能比普通飼料:為大鼠維持料，富含常規(guī)營養(yǎng)成分，能量密度13 769 kJ/kg，其中碳水化合物∶脂肪∶蛋白供能比例為63.3%∶12.3%∶24.4%。高脂飼料:由普通飼料加工而成，能量密度18 540 kJ/kg，碳水化合物∶脂肪∶蛋白供能比例為33.0%∶50.0%∶17.0%，質(zhì)量比為36.7%∶24.5%∶19.1%。普通飼料及高脂飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工。

糞便DNA提取喂養(yǎng)10周后，無菌鑷取新鮮成形大便置入無菌凍存管中，保存于-80℃冰箱中待檢。為了分析腸道菌群組成，通過糞便DNA提取試劑盒(OMEGA，D4015-01)提取糞便總DNA，置于-20℃以便于分析。采用NanodropTM1000(美國Thermo Scientific公司)測定所提取的糞便DNA濃度及純度。

Real-time PCR測定腸道菌群組成腸道細菌的PCR引物見表1，采用不同引物將提取的糞便DNA擴增，并稀釋為 (10-1～1.00) ×1010copies。采用Bio-Rad CFX96(美國BIO-RAD)熒光定量PCR儀，通過2-△△CT法進行相對定量分析，制作copies與CT值之間的標準曲線 (每種細菌及總DNA都要制作標準曲線)，然后以提取的DNA樣本為模版，進行定量PCR，通過標準曲線計算樣本中每種細菌的copies，通過不同細菌編碼16S rRNA的基因copies與總DNA copies的比值計算其相對含量。每個樣本重復3次取平均值。

血清內(nèi)毒素的測定經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，將大鼠固定在操作臺上，剃除大鼠腹部毛發(fā)，消毒后正中切口逐層進入腹腔，撥開橫結(jié)腸、肝臟及胃，暴露門靜脈。用注射器吸取血液抗凝劑 (廈門鱟試劑實驗公司)1 ml于無熱原試管中，一手固定門脈周圍組織，一手用無熱原注射器準確抽取門靜脈血1 ml注入試管中，和抗凝劑混勻，4℃下3000 r/min(r=190 mm)離心5 min，吸出上清液于-20℃冰箱中密封保存。采用改良偶氮基質(zhì)顯色鱟試劑盒 (廈門鱟試劑實驗公司)進行定量檢測內(nèi)毒素水平。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗;所有P值均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 Real-time PCR測定腸道菌群的引物Table 1 Primers used for bacterial quantification by real-time PCR

結(jié) 果

體重變化情況實驗開始前，CD組、HFD組、CD+n-3PUFAs組、HFD+n-3PUFAs組大鼠的平均體重分別為 (99.6±4.2)、 (103.2±7.4)、 (101.2±5.5)、 (103.4±6.4)g，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.613)。飼養(yǎng)10周后，HFD組大鼠的體重達到(660.5±26.3)g，明顯高于CD組的 (574.0±23.5)g(P=0.0002)，CD+n-3 PUFAs組的 (529.2±41.1)g(P=0.0001)和HFD+n-3PUFAs組的 (609.2±25.9)g(P=0.022)，CD組與CD+n-3PUFAs組間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.42)(表2)。

腸道菌群檢測結(jié)果飼養(yǎng)10周后，CD、HFD、CD+n-3PUFAs、HFD+n-3PUFAs組大鼠的糞便中DNA含量分別為 (68.29±45.20)、(42.32±36.33)、(76.13±41.88)、(29.35±26.91)ng/mg糞便，各組間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.076)。HFD組大鼠糞便中厚壁菌門 (P=0.002)和腸桿菌科 (P=0.022)的含量明顯高于CD組大鼠，擬桿菌門 (P=0.026)和雙歧桿菌屬 (P=0.034)含量明顯低于CD組。CD+n-3PUFAs組大鼠糞便中的擬桿菌門含量明顯高于CD組 (P=0.043)。HFD+n-3PUFAs組大鼠糞便中的厚壁菌門含量 (P=0.044)和腸桿菌科含量 (P=0.012)明顯低于HFD組，擬桿菌門含量明顯高于HFD組 (P=0.042)(表3)。

血清內(nèi)毒素檢測結(jié)果飼養(yǎng)10周后，CD、HFD、CD+n-3PUFAs、HFD+n-3PUFAs組大鼠的內(nèi)毒素分別為 (0.045±0.014)、(0.074±0.025)、(0.038±0.017)、(0.052±0.019)EU/ml，其中，HFD組明顯高于CD組 (P=0.007)，HFD+n-3PUFAs組明顯低于HFD組(P=0.042)，CD+n-3PUFAs組與CD組差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.210)。

表2 各組大鼠體重變化情況的比較 (x±s，g)Table 2 Comparison of body weights among four groups(x±s，g)

表3 各組腸道菌群含量的比較 (x ± s，%)Table 3 Comparison of gut microbiota contents among four groups(x ± s，%)

討 論

腸道菌群是肥胖研究的熱點之一，雖然已有大量研究證實腸道菌群在代謝能量中的作用，但目前仍對腸道菌群缺乏足夠的認識。飲食是導致肥胖的重要因素，動物實驗結(jié)果顯示高脂飲食可引起內(nèi)臟性肥胖［8-9］。高脂飲食 (脂肪供能占50%)飼養(yǎng)小鼠12周后可比普通飲食組小鼠增加60%的脂肪含量［10］。本研究結(jié)果亦顯示，高脂飲食 (脂肪供能占50%)可使大鼠體重明顯增加，而補充n-3PUFAs可減少體重，提示n-3PUFAs可能具有治療肥胖的作用。

肥胖涉及多種腸道菌群的改變，本研究選擇了常見的幾種與肥胖相關的細菌作為研究對象。由于取材原因，分析小腸內(nèi)菌群的組成比較困難，大多數(shù)研究集中在分析糞便或者結(jié)腸內(nèi)容物中的腸道菌群來反映腸道的菌群組成［5，11-12］。人和鼠腸道菌群90%以上為革蘭陽性厚壁菌門、革蘭陰性擬桿菌門。飲食因素是腸道菌群改變的主要原因，高脂飲食能引起厚壁菌門增多而減少擬桿菌門［13］。但有關腸道菌群主要兩種菌屬厚壁菌門和擬桿菌門在肥胖個體之間的含量仍有爭議［12，14-15］，這是因為由于個體飲食、行為及環(huán)境因素難以控制，甚至是在DNA提取過程中的偏差，導致不同的研究結(jié)論可能不一致。研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)厚壁菌門多于擬桿菌門會引起機體吸收食物中熱量的增加，從而引發(fā)肥胖［5］。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食可引起腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為厚壁菌門含量增高，而擬桿菌門含量降低，與國外研究結(jié)果類似［16-17］，雖然補充n-3PUFAs的劑量不同，結(jié)果仍顯示n-3PUFAs可調(diào)節(jié)腸道菌群，在高脂飲食情況下尤為明顯。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可引起雙歧桿菌屬的降低。已知糞便中雙歧桿菌屬含量可受膳食中纖維素的影響，推測本研究采用的高脂飲食中纖維素含量低可能是導致雙歧桿菌屬含量降低的原因。有研究顯示，補充油酸可以增加腸道內(nèi)雙歧桿菌屬的含量，但n-3PUFAs的作用不顯著［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)，n-3PUFAs增加雙歧桿菌屬含量的作用不明顯，但單獨補充雙歧桿菌屬有改善肥胖相關代謝綜合征的作用［18］，因此推測其改變可能與肥胖相關。

研究顯示，肥胖癥患者和動物的血清或脂肪組織中炎癥因子升高［19］，這些炎性因子在肥胖合并代謝綜合征中發(fā)揮重要作用。革蘭陰性細菌的產(chǎn)物內(nèi)毒素被認為是啟動肥胖相關炎癥的重要因素之一，Ghoshal等［20］研究發(fā)現(xiàn)，不同種類脂肪酸對內(nèi)毒素吸收可發(fā)揮不同的作用。高脂飲食中過多飽和脂肪酸的攝入可導致腸道微生物構(gòu)成發(fā)生改變，損傷腸黏膜屏障，引起內(nèi)毒素入血，刺激肥胖相關低度炎癥及代謝綜合征［21］。腸桿菌科分解可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，高脂飲食增加腸桿菌科含量。高脂飲食同時補充n-3PUFAs可以顯著降低門靜脈血內(nèi)毒素水平，調(diào)節(jié)產(chǎn)生內(nèi)毒素的革蘭陰性菌腸桿菌科的含量。

［1］Chen CM.Overview of obesity in Mainland China ［J］.Obes Rev，2008，9(s1):14-21.

［2］Nakamura Y，Turin TC，Kita Y，et al.Associations of obesity measures with metabolic risk factors in a community-based population in Japan ［J］.Circ J，2007，71(5):776-781.

［3］Qin J，Li R，Raes J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing ［J］.Nature，2010，464(7285):59-65.

［4］B?ckhed F，Ding H，Wang T，et al.The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(44):15718-15723.

［5］Turnbaugh PJ，Ley RE，Mahowald MA，et al.An obesityassociated gut microbiome with increased capacity for energy harvest［J］.Nature，2006，444(7122):1027-1131.

［6］Cani PD，Amar J，Iglesias MA，et al.Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance ［J］.Diabetes，2007，56(7):1761-1772.

［7］Buckley JD，Howe PR.Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids may be beneficial for reducing obesity-a review［J］.Nutrients，2010，2(12):1212-1230.

［8］Munro IA，Garg ML.Dietary supplementation with long chain omega-3 polyunsaturated fatty acids and weight loss in obese adults ［J］.Obes Res Clin Pract，2013，7(3):e173-e181.

［9］Zhang C，Zhang M，Wang S，et al.Interactions between gut microbiota，host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice ［J］.ISME J，2010，4(2):232-241.

［10］Qiao Y，Sun J，Xia S，et al.Effects of resveratrol on gut microbiota and fat storage in a mouse model with high-fat-induced obesity ［J］.Food Funct，2014，DOI:10.1039/C3FO60630A.

［11］Turnbaugh PJ，B?ckhed F，F(xiàn)ulton L，et al.Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome ［J］.Cell Host Microbe，2008，3(4):213-223.

［12］Ley RE，B?ckhed F，Turnbaugh P，et al.Obesity alters gut microbial ecology［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(31):11070-11075.

［13］Hildebrandt MA，Hoffmann C，Sherrill-Mix SA，et al.Highfat diet determines the composition of the murine gut microbiome independently of obesity ［J］.Gastroenterology，2009，137(5):1716-1724.

［14］Lyra A，Lahtinen S，Tiihonen K，et al.Intestinal microbiota and overweight ［J］.Benef Microbes，2010，1(4):407-421.

［15］Turnbaugh PJ，Hamady M，Yatsunenko T，et al.A core gut microbiome in obese and lean twins ［J］.Nature，2009，457(7228):480-484.

［16］Mujico JR，Baccan GC，Gheorghe A，et al.Changes in gut microbiota due to supplemented fatty acids in diet-induced obese mice ［J］.Br J Nutr，2013，110(4):711-720.

［17］Pachikian BD，Neyrinck AM，Portois L，et al.Involvement of gut microbial fermentation in the metabolic alterations occurring in n-3 polyunsaturated fatty acids-depleted mice ［J］.Nutr Metabol，2011，8(1):44-55.

［18］Chen JJ，Wang R，Li XF，et al.Bifidobacterium longum supplementation improved high-fat-fed-induced metabolic syndrome and promoted intestinal Reg I gene expression ［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2011，236(7):823-831.

［19］Kim KA，Gu W，Lee IA，et al.High fat diet-induced gut microbiota exacerbates inflammation and obesity in mice via the TLR4 signaling pathway ［J］.PLoS One，2012，7(10):e47713.

［20］Ghoshal S，Witta J，Zhong J，et al.Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides ［J］.J Lipid Res，2009，50(1):90-97.

［21］Beguin P，Errachid A，Larondelle Y，et al.Effect of polyunsaturated fatty acids on tight junctions in a model of the human intestinal epithelium under normal and inflammatory conditions ［J］.Food Funct，2013，4(6):923-931.