TXNDC5介導(dǎo)缺血清誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞增殖抑制

張紅飛，張潔雯，孔麗娟，王 樂，朱 寧，郭思超，邱 川，閆雪靜，陳梅紅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005

TXNDC5最早被認(rèn)為是硫氧還蛋白 (thioredoxin，Trx)家族的一個新成員［1］，絕大多數(shù)分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，也有少部分定位于細(xì)胞膜表面，由于其包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (protein disulfide isomerases，PDI)家族成員所特有的Trx結(jié)構(gòu)域，因此也被認(rèn)為是PDI家族成員［2］。TXNDC5具有多種生物學(xué)功能，目前認(rèn)為它可能參與細(xì)胞的生長、運(yùn)動、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多個過程。最新研究發(fā)現(xiàn)，TXNDC5在體內(nèi)可能起壓力生存因子、胰島素調(diào)節(jié)因子、硝化反應(yīng)生存因子等的作用［2-6］。TXNDC5在胃癌、肺癌、肝癌等多種人類腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)并且明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及遷徙［7-9］。許多研究表明，缺血清能夠減少腫瘤細(xì)胞的基本活動，促使細(xì)胞增殖的同步化，并且缺血清已經(jīng)成為研究細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等分子機(jī)制的一種常用方法［10-13］。本研究觀察了TXNDC5在缺血清對人宮頸癌HeLa細(xì)胞系增殖抑制中的作用。

材料和方法

材料HeLa細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，DMEM(high glucose)培養(yǎng)基、無酚紅DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone(Thermo Scientific)公司，胎牛血清購自德國Biochrom公司，0.5%活性炭吸附胎牛血清購自美國Nalgene公司;SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase、TRIzolTM、Lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司，GoTaq?Probe qPCR Master Mix、CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay Kit購自美國Promega公司，Pierce?RIPA Buffer、 HaltTMProtease Inhibitor Cocktail、 HaltTMPhosphatase Inhibitor Cocktail購自美國Thermo Scientific公司，Actinomycin D和Cycloheximide購自美國Sigma公司;pCM-H1U6表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室自建［14］;siTX-1、2、3 pCM-H1U6-siTXNDC5表達(dá)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室自建，其中的siTXNDC5序列購自美國Dharmacon公司 (siTX-1:5’-GCAGAGACCTTGACTCGTA-3’;siTX-2:5’-GGAAT AACCTTCATCAAGA-3’;siTX-3:5’-GGTGATGAAAGC AGCGTTA-3’);Anti-TXNDC5 Goat polyclonal antibody、Anti-β-actin Mouse monoclonal antibody購自英國 Abcam公司，ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRPSubstate購自美國Millipore公司，BioRad iQ5熒光定量PCR儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司。

細(xì)胞培養(yǎng)和缺血清誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液1次。當(dāng)將正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞換用含0.5%活性炭吸附胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時，即為進(jìn)行缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d按細(xì)胞數(shù)1×105個/孔鋪于24孔板各孔中，次日轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%即可轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將各表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞中，具體步驟按說明書操作。在轉(zhuǎn)染后12 h吸棄含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，改為加入500 μl含0.5%活性炭吸附胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0～4 d進(jìn)行缺血清處理。

放線菌素D處理細(xì)胞在HeLa細(xì)胞進(jìn)行正常血清和缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，按細(xì)胞數(shù)5×105個/孔鋪板于6孔板各孔中，加入適量的放線菌素D使其終濃度為5 μg/ml。充分混勻后，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、10、15 h 3個時間點(diǎn)后收集細(xì)胞檢測。

放線菌酮處理細(xì)胞HeLa細(xì)胞以2×105個/孔鋪板于6孔板各孔中，待細(xì)胞貼壁后，加入放線菌酮使其終濃度為1 μg/ml。充分混勻后，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，然后在放線菌酮存在條件下對細(xì)胞進(jìn)行缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于缺血清培養(yǎng)0、1、2d 3個時間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用Western blot法檢測TXNDC5蛋白水平。

RNA提取和qRT-PCR離心收集細(xì)胞后，用1×PBS重懸細(xì)胞清洗3次，棄上清加入1 ml TRIzolTM，按照廠家說明書嚴(yán)格提取高質(zhì)量總RNA。然后，根據(jù)SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄步驟將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Taq-man探針法，按照GoTaq?Probe qPCR Master Mix說明書配制各反應(yīng)組分制備成qRT-PCR檢測體系，于BioRad iQ5熒光定量PCR儀中檢測。以β-actin為內(nèi)參照基因，采用相對定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

MTS法檢測細(xì)胞增殖按照說明書操作，具體為:轉(zhuǎn)染24 h后，各組細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別分到96孔板內(nèi)，每孔1500個細(xì)胞重懸于100μl的10% 血清DMEM培養(yǎng)基中。選取轉(zhuǎn)染后經(jīng)缺血清處理0、1、2、3、4 d這幾個時間點(diǎn)的細(xì)胞，每組在每個時間點(diǎn)各計(jì)數(shù)3個復(fù)孔分別檢測。檢測時每孔逐滴加入20 μl的CellTiter96?AQueous One Solution Reagent試劑，其內(nèi)含1個新型四唑化合物MTS，充分混合均勻后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm波長處測吸光度A值。每組的3個復(fù)孔A值，以含10%血清的DMEM培養(yǎng)基為空白對照調(diào)零后取均值。

Western blot檢測收集各組細(xì)胞并根據(jù)細(xì)胞的量加入相應(yīng)量的細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，重懸混勻后于冰上振蕩15 min，再4℃、15 000×g離心20 min后取上清，Nanodrop測定蛋白濃度。以30 μg/孔總蛋白上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后5%BSA于搖床上室溫封閉2 h。按適宜比例用5%BSA稀釋配制一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗10 min/次共3次，再用HRP標(biāo)記的二抗于搖床上室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min/次共3次，最后于暗室內(nèi)用ECL發(fā)光試劑盒曝光X光片、顯影并定影。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，PBS洗3遍，用-20℃預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，4℃固定過夜。1000×g離心5 min，棄上清，4℃預(yù)冷的1×PBS洗1次。加入RNase，使其終濃度為100 μg/ml，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。加入250 μl的1×PBS稀釋過的 PI染色，使其終濃度為50 μg/ml，37℃孵育20 min。加1×PBS使其總體積為500 μl。細(xì)胞經(jīng)過濾網(wǎng)過濾后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡采用Annexin V FITC/PI雙染法，收集轉(zhuǎn)染12 h后撤血清處理的1 d各組細(xì)胞，1×PBS洗2遍后用100 μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI(同時做以FITC單染及PI單染的陰性對照，未染組做空白對照)，輕輕混勻后置于室溫下避光孵育15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer，經(jīng)過濾網(wǎng)過濾后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間資料比較采用方差分析LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

缺血清上調(diào)TXNDC5蛋白水平正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞經(jīng)缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)1～3 d后，HeLa細(xì)胞增殖受到抑制;而當(dāng)缺血清3 d后再加入血清進(jìn)行正常培養(yǎng)4 h后，細(xì)胞逐步恢復(fù)正常增殖 (圖1A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，在缺血清后1 d時，TXNDC5 mRNA水平明顯下降 (P＜0.05)(圖1B)。缺血清后TXNDC5的蛋白水平升高 (圖1C)。

圖1 缺血清對HeLa細(xì)胞增殖和TXNDC5的mRNA和蛋白水平的影響Fig 1 Effect of serum starvation on HeLa cell proliferation and the mRNA and protein level of TXNDC5

缺血清不影響TXNDC5 mRNA的半衰期HeLa細(xì)胞經(jīng)正常和缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，加入放線菌素D處理0、10、15 h收細(xì)胞總RNA，qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，缺血清組細(xì)胞中TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性沒有變化 (圖2)。

在放線菌酮存在時缺血清不能誘導(dǎo)TXNDC5蛋白水平的升高在放線菌酮存在條件下進(jìn)行缺血清誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于缺血清培養(yǎng)0、1、2 d收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示在放線菌酮存在時進(jìn)行缺血清培養(yǎng)，TXNDC5的蛋白水平無變化(圖3)。

在血清充足條件下TXNDC5的水平對HeLa細(xì)胞的增殖無明顯影響正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TXNDC5質(zhì)粒24 h后，TXNDC5的蛋白水平顯著升高 (圖4A)，但TXNDC5過表達(dá)對HeLa細(xì)胞的增殖沒有影響 (圖4B)。當(dāng)細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染siTXNDC5-1、siTXNDC5-2和 siTXNDC5-3表達(dá)質(zhì)粒72 h后，TXNDC5的蛋白水平明顯降低 (圖4C)。與轉(zhuǎn)染空載體對照組相比，轉(zhuǎn)染siTXNDC5-1和siTXNDC5-3組細(xì)胞在第3天時細(xì)胞數(shù)減少，轉(zhuǎn)染siTXNDC5-1和siTXNDC5-2組細(xì)胞在第4天時細(xì)胞數(shù)減少 (圖4D)，3個siTXNDC5中僅siTXNDC5-1可使細(xì)胞增殖速度略有減慢，siTXNDC5-2和siTXNDC5-3僅在1個時間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)有所減少，其對細(xì)胞增殖速度的影響不大。

圖2 缺血清對TXNDC5 mRNA穩(wěn)定性的影響Fig 2 Effect of serum starvation on the stability of TXNDC5 mRNA

圖3 放線菌酮存在時缺血清對TXNDC5蛋白水平的影響Fig 3 Effect of serum starvation on the expression level of TXNDC5

圖4 TXNDC5的表達(dá)水平對HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effect of TXNDC5 expression level on HeLa cell proliferation

抑制TXNDC5的表達(dá)減弱缺血清誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞增殖抑制正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pCMH1U6-siTXNDC5質(zhì)粒12 h后，再缺血清培養(yǎng)0～3 d，Western blot檢測結(jié)果顯示，缺血清條件下TXNDC5的表達(dá)逐步被抑制 (圖5A);與對照組相比，隨著TXNDC5表達(dá)的抑制，缺血清誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制也相應(yīng)減弱 (圖5B);轉(zhuǎn)染pCM-H1U6-siTXNDC5質(zhì)粒12 h后再缺血清誘導(dǎo)1 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明抑制TXNDC5的表達(dá)使S期細(xì)胞比例略有增加 (圖5C)，而對細(xì)胞凋亡無明顯影響 (圖5D)。

圖5 抑制TXNDC5的表達(dá)對缺血清誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞增殖抑制的影響Fig 5 Effect of TXNDC5 knockdown on serum starvation-induced HeLa cell proliferation inhibition

討 論

本研究結(jié)果顯示，在HeLa細(xì)胞中，缺血清誘導(dǎo)TXNDC5的蛋白水平顯著升高，而TXNDC5的mRNA水平卻沒有明顯升高，甚至在缺血清的第1天還略有降低。缺血清并不影響TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性，表明TXNDC5蛋白水平的升高并非是由于mRNA的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性增強(qiáng)所致。在蛋白翻譯抑制劑放線菌酮存在的條件下，缺血清則不能誘導(dǎo)TXNDC5蛋白水平的升高，顯示缺血清可能主要通過增強(qiáng)TXNDC5的翻譯而上調(diào)其蛋白水平。細(xì)胞在缺血清時會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使許多基因的表達(dá)被抑制，在缺血清的第1天TXNDC5的mRNA略有降低，可能就是這種應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)。而一些在應(yīng)激中發(fā)揮作用的基因，例如凋亡相關(guān)基因則在應(yīng)激時仍能保持高的翻譯效率［15］。缺血清的第1天TXNDC5的mRNA略有降低，而此時TXNDC5的蛋白水平卻明顯升高，提示在缺血清的應(yīng)激反應(yīng)中，TXNDC5是細(xì)胞活動所必需的基因，可能參與介導(dǎo)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，TXNDC5過表達(dá)對缺血清抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用無影響，推測原因可能是因?yàn)槿毖逡咽辜?xì)胞中的TXNDC5蛋白水平大幅升高，此時外源性表達(dá)的TXNDC5的作用在大量內(nèi)源性TXNDC5的掩蓋下很難表現(xiàn)出來。抑制TXNDC5的表達(dá)則使缺血清抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用減弱，表現(xiàn)為當(dāng)TXNDC5的表達(dá)被抑制后，缺血清時處于S期的細(xì)胞比例增加。而在血清充足條件下，過表達(dá)TXNDC5對HeLa細(xì)胞的增殖速度無影響，抑制TXNDC5也只是輕微減小HeLa細(xì)胞的增殖速度。Chang等［16］報道抑制TXNDC5的表達(dá)使HeLa細(xì)胞增殖速度減慢，減慢的幅度雖然不大但比本研究的結(jié)果要顯著。推測原因可能是，Chang等［16］使用的是化學(xué)合成的TXNDC5 siRNA，且只有1條siRNA，而本研究采用載體表達(dá)的3種不同的TXNDC5 siRNA，這兩種方法中陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組設(shè)置的不同。但Chang等［16］的結(jié)果與本研究結(jié)果都顯示，在血清充足條件下，抑制TXNDC5的表達(dá)即使能減慢HeLa細(xì)胞的增殖速度，其作用也是比較微弱的，而這與本研究中在缺血清條件下，抑制TNXDC5的表達(dá)能加快HeLa細(xì)胞增殖速度的結(jié)果是相反的，顯示TXNDC5在血清充足和缺乏條件下發(fā)揮了不同的作用。

研究顯示，TXNDC5在絕大部分腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤細(xì)胞增殖侵襲遷移和凋亡密切相關(guān)［7-8］，可能具有癌基因的作用。也有文獻(xiàn)報道，缺氧能誘導(dǎo)TXNDC5表達(dá)升高從而有利于細(xì)胞在壓力環(huán)境下的存活，說明TXNDC5在壓力條件下發(fā)揮作用［2，17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血清誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞中TXNDC5的表達(dá)升高，TXNDC5介導(dǎo)了缺血清誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞增殖抑制作用?？赡茉谘宄渥愕臈l件下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)的TXNDC5促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲的惡性表型，而當(dāng)血清缺乏時，腫瘤細(xì)胞內(nèi)TXNDC5的蛋白水平進(jìn)一步大幅升高，反而使細(xì)胞增殖速度降低。腫瘤在體內(nèi)由于生長迅速，經(jīng)常會遇到缺氧、缺血等壓力環(huán)境，在血清充足時腫瘤細(xì)胞生長加快，而在壓力環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的增殖減慢，等待環(huán)境條件好轉(zhuǎn)后恢復(fù)增殖，體現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我保護(hù)和存活能力。本研究結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞在含5%血清的低血清培養(yǎng)基中，增殖速度明顯減慢，但不發(fā)生凋亡，一旦血清供應(yīng)恢復(fù)，HeLa細(xì)胞重新進(jìn)入快速增殖狀態(tài)。TXNDC5在血清充足條件下促進(jìn)細(xì)胞增殖和在缺血清條件下介導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制的作用提示，TXNDC5可能在腫瘤細(xì)胞自我保護(hù)和存活中起重要作用。

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