HPLC法快速檢測(cè)生物樣品中溴敵隆

馬紅娟，徐志敏，楊 磊，劉小玲，李梅華，鐘菊花，馬錦琦

·法醫(yī)學(xué)·

HPLC法快速檢測(cè)生物樣品中溴敵隆

馬紅娟1，徐志敏2，楊 磊1，劉小玲1，李梅華1，鐘菊花1，馬錦琦1

目的通過HPLC建立一種快速、有效的溴敵隆含量檢測(cè)方法。方法分別采用甲醇、乙醇和丙酮提取血液檢材中的溴敵隆，通過改變萃取溶劑，考察回收率，使用HPLC檢測(cè)，比較提取效果。結(jié)果本法檢測(cè)生物檢材中的溴敵隆，在1～100 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R2=0.9973)；甲醇、乙醇和丙酮提取的加標(biāo)平均回收率分別為78.5%，83.5% 和77.9%。結(jié)論本方法快速、有效，改進(jìn)了生物檢材中溴敵隆含量檢測(cè)的法醫(yī)毒物分析方法，也可應(yīng)用于中毒病人的早期診斷。

HPLC；溴敵?。谎?/p>

溴敵隆是第二代抗凝血?jiǎng)缡笏?，近年來雖有采用HPLC、LC-MS等方法檢驗(yàn)溴敵隆，但是多為糧食、飼料等體外樣品。經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)代謝或經(jīng)體內(nèi)組織提取、檢測(cè)溴敵隆的方法少，且提取回收率較低，不能達(dá)到檢測(cè)要求[2]，本研究通過HPLC建立一種快速有效的溴敵隆含量檢測(cè)方法。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器：Waters高效液相色譜儀，配有1525二元泵和 2487 二極管陣列檢測(cè)器(美國 Waters 公司)；TG 328B 電光分析天平(上海天平儀器廠)；F8010AP無油真空泵(天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。試劑：溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)品(98.0%，德國Dr.公司)、甲醇、無水乙醇、丙酮均為HPLC級(jí)，磷酸、磷酸二氫鉀等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水來自Milii-Q純水系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠20只(LD50組7只、半LD50組7只、空白組6只)購自本校動(dòng)物中心。

1.2樣品處理溴敵隆的小鼠LD50為0.21 mg/mL。實(shí)驗(yàn)組分別以LD50組、1/2LD50組，用灌胃法灌入溴敵隆稀釋液，空白組灌喂生理鹽水各0.4 mL，1周后統(tǒng)一處死，解剖取肝組織、胃組織、靜脈血，對(duì)所得檢材以直接提取法，分別用甲醇、乙醇、丙酮提純萃取，萃取液濃縮、定容至500 μL。

1.3樣品檢測(cè)色譜條件：色譜柱為Symmetry?C18反相柱(4.6×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(pH=3)：甲醇=0.18∶0.82；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。峰形良好，出峰時(shí)間為5 min左右，穩(wěn)定性好[4]。

2 方法與結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL，得到濃度為0.8 mg/mL的儲(chǔ)備液。用此儲(chǔ)備液制成1、5、10、20、50、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.3條件進(jìn)行測(cè)定，得到線性回歸方程y=32311x+45324(r2=0.9973)。在確定濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2樣品測(cè)定進(jìn)樣針準(zhǔn)確抽取10 μL樣品處理液在1.3條件下HPLC法檢測(cè)，得到樣品液的出峰時(shí)間與峰面積，得出結(jié)果見表1。

表1 不同樣品中溴敵隆含量 μg/g

2.3精密度及回收率取空白血液添加溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙醇、甲醇、丙酮提取，提取液經(jīng)檢測(cè)計(jì)算平均回收率分別為83.5%、78.5%、77.9%。對(duì)同一樣品重復(fù)檢測(cè)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD<10%。測(cè)得最低檢測(cè)限16 ng/mL(s/n>3)。

2.4結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇、甲醇、丙酮均可對(duì)溴敵隆進(jìn)行提取，但血液、肝臟用乙醇提取的萃取率高于甲醇和丙酮。

2 討論

溴敵隆化學(xué)名是：3-(4-羥基-3-香豆素)-3-苯基-1-(對(duì)溴聯(lián)苯基)-丙醇-1，其對(duì)很多種動(dòng)物都有很強(qiáng)的毒性，可以通過消化道、皮膚和呼吸道吸收而導(dǎo)致中毒。溴敵隆的結(jié)構(gòu)與維生素K相似，可在肝臟中與維生素K競(jìng)爭(zhēng)，抑制凝血酶原和凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的生物合成，導(dǎo)致凝血障礙，其體內(nèi)代謝產(chǎn)物亞芐基丙酮還可損害毛細(xì)血管壁，使其通透性增強(qiáng)，血液易滲出，導(dǎo)致大出血而死亡。其生物半衰期為6 d，最大效應(yīng)在12～15 d，所以中毒后需要很長(zhǎng)的治療時(shí)間(通常2～4周)[1]。由于它作用緩慢、不易引起鼠類警覺、易殲滅鼠害的特點(diǎn)，而且具有適口性好、毒力強(qiáng)、靶譜廣的特性，單劑量使用對(duì)各種鼠類都能有效防除。以此作為有效成分，配以溶劑、組溶劑及誘食劑等制成的滅鼠毒餌，常用于家庭、社區(qū)、公共場(chǎng)所等不同環(huán)境殺滅鼠害，容易發(fā)生誤食等情況。由于初期癥狀不明顯，常常被忽視，而不能盡早做出診斷，影響醫(yī)治。

溴敵隆作為一種使用頻繁、在機(jī)體內(nèi)作用較慢的低毒鼠藥，常有小兒誤食等情況發(fā)生，其在中毒者體內(nèi)含量不高，臨床上往往因不能盡早做出診斷而影響醫(yī)治。近年來雖有采用HPLC、LC-MS等方法檢驗(yàn)溴敵隆，但是多為糧食、飼料等體外樣品，經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)代謝或經(jīng)體內(nèi)組織提取、檢測(cè)溴敵隆的方法很少。雖有齊孝蕊利用離子液體分散液相色譜微萃取技術(shù)提取檢測(cè)生物檢材中的溴敵隆[3]，但操作不易，不適宜快速檢測(cè)。臨床發(fā)生中毒事件后，常常需要在短時(shí)間內(nèi)做出診斷，以利于盡早救治。本課題采用高效液相色譜法(HPLC)，用甲醇、乙醇、丙酮提純、萃取檢材，操作簡(jiǎn)便易行，配合適當(dāng)?shù)纳V條件，乙醇的加標(biāo)平均回收率為83.5%，滿足方法學(xué)要求，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。且方法成本較小，成熟后可應(yīng)用于中毒患者的早期診斷。

[1]董天義，顏丙申.三種新抗凝血?jiǎng)┦箴D防制家棲鼠實(shí)驗(yàn)室效果評(píng)價(jià)[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2004，20(6)：333-337.

[2]趙海雨，宋鳴.HPLC-ESI-MS/MS法測(cè)定全血中溴敵隆[J].刑事技術(shù)，2008，(5)：16.

[3]齊孝蕊，周海梅，呂坪，等.離子液體分散液相微萃取-HPLC檢測(cè)血漿中溴敵隆[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(4)：282-283.

QuickDetectionofBromadialoneofBiologicalSamplesbyHPLC

MA Hong-juan,YANG Lei,LIU Xiao-ling,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo establish a rapid and effective method for determining the content of bromadialone in blood,investigating the recovery to obtain the best treatment condition during changing the extraction solvents.MethodsUsing the methanol,ethanol and acetone to extract the bromadialone in blood samples respectively,and then compared the results of extraction by HPLC.ResultsUnder the conditions of this method,the good linear relationship was obtained in the range of 1～100 μg/mL(R2=0.9973);the average recoveries of extraction with methanol,ethanol and acetone were 78.5%,83.5% and 77.9% respectively.ConclusionThis method is rapid and effective for the detection of bromadialone and the improvement for the forensic toxicology analysis of bromadialone in biological samples,and also can be used for the early diagnosis of poisoning patients.

HPLC；bromadiolone；blood

河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(2013228)

2014-07-28

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

1.馬紅娟(1992-)，女，河南永城人，從事法醫(yī)毒化研究。 2.義馬市人民檢察院，河南義馬 472300

馬錦琦，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，E-mail：hnrluccky@mail.haust.edu.cn

DF795.4

A

1672-688X(2014)03-0227-02