六種食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)

張勝娟，夏文彤，楊曉輝，張庭廷

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

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六種食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)

張勝娟1，夏文彤2，楊曉輝3，張庭廷4

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

通過(guò)對(duì)藻密度、抑制率等相關(guān)參數(shù)的測(cè)定，分別研究了金龍魚(yú)食用油、大豆油、花生油等6種常見(jiàn)食用油對(duì)銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa Kutz.)生長(zhǎng)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金龍魚(yú)食用油能有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，并具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，一定時(shí)間范圍內(nèi)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系.而3.0×105cells/ml的銅綠微囊藻，其半抑制濃度(EC50)最高可達(dá)4.18ml/L.

銅綠微囊藻；金龍魚(yú)食用油；脂肪酸；抑藻效應(yīng)

近年來(lái)，隨著城市化和工業(yè)化的快速發(fā)展，大量生活和工業(yè)廢水被排入江河湖泊，導(dǎo)致了淡水水體的富營(yíng)養(yǎng)化，每至春夏之際，藻類(lèi)水華頻繁爆發(fā)，而水華藻類(lèi)極易腐敗，不僅能降低水體的含氧量，還能釋放大量毒素，對(duì)人類(lèi)淡水資源和水生生物的生存環(huán)境造成嚴(yán)重破壞[1].因此，如何有效控制水華藻類(lèi)是維護(hù)人類(lèi)生存環(huán)境的重大課題之一.淡水水華主要是藍(lán)藻，而藍(lán)藻中最常見(jiàn)的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是藍(lán)藻水華的主要元兇[2].銅綠微囊藻是一種單細(xì)胞藻類(lèi)，屬藍(lán)藻門(mén)、微囊藻屬，它所產(chǎn)生的藻毒素能夠致癌，可嚴(yán)重威脅野生動(dòng)植物及人類(lèi)健康[3].

目前，利用化感物質(zhì)治理水華是水華治理的主要研究方向.化感物質(zhì)是水生植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，一般能在自然環(huán)境中降解，不會(huì)在生態(tài)系統(tǒng)中長(zhǎng)期積累[4]，故其生態(tài)安全性良好.迄今為止，發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分成5大類(lèi)：脂肪族、芳香族、含氧雜環(huán)化合物、類(lèi)萜和含氮化合物[5].其中脂肪酸作為一種重要化感物質(zhì)，存在于許多植物的根莖葉中，在控制藍(lán)藻水華過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.Yasushi[6]等(2003)證明長(zhǎng)鏈脂肪酸能夠強(qiáng)烈抑制羊甲綠芽藻(Selenastrumcapricornutum)正常生長(zhǎng).Ikawa等[7](1984)發(fā)現(xiàn)C14-C18脂肪酸對(duì)綠藻(Chtorellapyrenoidosa)的生長(zhǎng)也具有強(qiáng)烈的抑制作用；Zhang等[8](2008)從普生輪藻中分離出亞油酸、軟脂酸和豆蔻酸，并發(fā)現(xiàn)它們均有不同程度的抑藻效應(yīng)；同時(shí)還研究了17種不同碳鏈長(zhǎng)度、不同飽和程度脂肪酸類(lèi)物質(zhì)的抑藻作用；發(fā)現(xiàn)各種脂肪酸均有一定的抑藻效應(yīng)，抑藻活性與脂肪酸的結(jié)構(gòu)有關(guān)；不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸的抑藻效應(yīng)好，不飽和程度越高，抑藻效應(yīng)越明顯；飽和脂肪酸中碳鏈越短，化感抑藻效應(yīng)越強(qiáng).

為此，本實(shí)驗(yàn)所選用的材料是以脂肪酸為主要成分的食用油類(lèi)，即金龍魚(yú)食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油，這些油從天然植物中提取，對(duì)環(huán)境相對(duì)安全無(wú)毒，不會(huì)造成諸如化學(xué)試劑抑藻所帶來(lái)的二次污染及生態(tài)毒性.實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為水華常見(jiàn)藻類(lèi)——產(chǎn)毒銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，擬通過(guò)研究分析上述6種常見(jiàn)食用油對(duì)產(chǎn)毒銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，尋找出抑藻效應(yīng)強(qiáng)的食用油.為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)生物除藻劑提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中使用的6種食用油分別選定為：金龍魚(yú)食用調(diào)和油(金龍魚(yú)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品)、大豆油(中糧艾地盟糧油工業(yè)有限公司產(chǎn)品)、山茶油(金華市金山油脂有限公司產(chǎn)品)、壓榨花生油(山東魯花集團(tuán)有限公司產(chǎn)品)、芝麻油(北京金亭建鑫食用油有限公司產(chǎn)品)、菜籽油(江蘇紅蜻蜓油脂有限責(zé)任公司產(chǎn)品)，以上材料均購(gòu)于沃爾瑪超市，所有食用油均為一級(jí)油.

實(shí)驗(yàn)藻種銅綠微囊藻FACHB-942(MicrocystisaeruginosaFACHB-942)由中國(guó)科學(xué)院武漢水生所淡水藻種庫(kù)提供.

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Motic數(shù)碼顯微鏡(德國(guó)Motic有限公司)；血球計(jì)數(shù)板(上海精密儀器儀表有限公司)；微孔過(guò)濾器，0.22μm微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)；注射器(上海中鴿注射器有限公司)；光照培養(yǎng)箱PGX-250B(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)；架物托盤(pán)天平(上海斗門(mén)五金工具有限公司)；電子天平FA1104(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；無(wú)菌操作臺(tái)(新加坡ESCO有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠).

1.3藻種培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，向已經(jīng)高溫濕熱滅菌的250ml錐形瓶?jī)?nèi)加入100ml的BG-11培養(yǎng)基[9]，加入銅綠微囊藻藻種，搖勻后放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).培養(yǎng)條件為:溫度24±2℃，光周期12L/12D，光照強(qiáng)度4000lx.每天振蕩搖勻4-5次，實(shí)驗(yàn)前7天，對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每天加入新鮮培養(yǎng)基，使之處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.

1.4抑藻實(shí)驗(yàn)

使用0.22μm微孔過(guò)濾器，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)材料：金龍魚(yú)食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油進(jìn)行過(guò)濾以除去微生物，置于無(wú)菌環(huán)境中備用.在無(wú)菌條件下，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻，用已滅菌BG-11培養(yǎng)基稀釋藻液，使得銅綠微囊藻液的藻密度為3.0×105cells/ml.

分別取出已稀釋的藻液40ml加入100ml錐形瓶中，再加入各種待測(cè)試的食用油，使得各種油的最終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml/L.另外設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組，即只含相同藻密度的藻液；每組三個(gè)平行，置于1.3相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期為8天，每隔48h用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞數(shù).

1.5對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)影響的參數(shù)測(cè)定

1.5.1 藻密度 通過(guò)對(duì)藻細(xì)胞的計(jì)數(shù)來(lái)反映食用油對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，每隔48h統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞1次，算出當(dāng)天的藻細(xì)胞密度，連續(xù)計(jì)數(shù)8天.

1.5.2 抑制率與半抑制濃度 6種食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制百分率(Inhibition Ratio)公式為：IR(%)=(1-N/N0)×100%，其中：IR——抑制率；N——處理組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)；N0——對(duì)照組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)；將各浸提液的濃度及殺藻劑的用量與相應(yīng)處理組生長(zhǎng)抑制率做一元線性回歸，求出半抑制濃度EC50(ml/L).

1.5.3 比增長(zhǎng)率 銅綠微囊藻的比增長(zhǎng)率的計(jì)算公式：μ=Ln(Xn/X=(n-1)/(tn-tn-1)，其中μ為比增長(zhǎng)率；Xn、Xn-1分別為當(dāng)天和2天前的銅綠微囊藻的藻密度；tn、tn-1分別對(duì)應(yīng)于Xn、Xn-1的培養(yǎng)時(shí)間.

1.6統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件和SPSS13.0軟件處理，相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.16種食用油對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

圖1顯示的是6種食用油對(duì)銅綠微囊藻藻密度的影響.各處理組在2d內(nèi)變化不大，從4d后開(kāi)始表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì).金龍魚(yú)食用油處理組從0.2ml/L—8.0ml/L，每個(gè)處理組的藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均低于同期對(duì)照組生長(zhǎng)曲線，隨處理時(shí)間增加，藻密度和同期對(duì)照組差距越大；觀察各濃度的處理組藻密度變化情況，可發(fā)現(xiàn)濃度越高，藻細(xì)胞密度越低；而其他5種食用油處理組各組生長(zhǎng)曲線與同期對(duì)照組相比較，差距并不明顯，甚至有些濃度處理組的藻密度還高于對(duì)照組；這可能是因?yàn)檫@5種食用油對(duì)銅綠微囊藻并沒(méi)有明顯的抑制作用；綜合比較6種食用油對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，可以發(fā)現(xiàn)金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻有較明顯的抑制作用，且濃度與抑制效果正相關(guān).

◇:ck,□:0.5ml/L,△:1.0ml/L,×:2.0ml/L,○:4.0ml/L,+:8.0ml/L,

圖1 金龍魚(yú)食用油(A)、大豆油(B)、山茶油(C)、花生油(D)、芝麻油(E)、菜籽油(F)對(duì)銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度的影響
Fig 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish(A)、soybean oil(B)、camellia oil(C)、peanut oil(D)、sesame oil(E)、rapeseed oil(F)on algae cell density of M.aeruginosa.

2.2金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻比增長(zhǎng)率的影響

表1顯示的是金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻比增長(zhǎng)率的影響，與同期對(duì)照組比較，金龍魚(yú)食用油的各處理組比增長(zhǎng)率均低于同期對(duì)照組，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，比增長(zhǎng)率較對(duì)照組越低，在第8天8.0ml/L處理組出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng).說(shuō)明金龍魚(yú)食用油能明顯抑制銅綠微囊藻藻細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，濃度越高抑制效果越明顯.

表1 金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻比增長(zhǎng)率的影響Table 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish on specific growth rate of M.aeruginosa

*與同期對(duì)照組比較，P<0.05；**與同期對(duì)照組比較，P<0.01

2.3金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率

表2顯示,金龍魚(yú)食用油各處理組隨處理時(shí)間的增加，抑制率明顯升高，比較同期各處理組的抑制率，還可發(fā)現(xiàn)濃度越高，抑制率越高，8.0ml/L處理組在第8天抑制率達(dá)70%左右，說(shuō)明金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻有明顯的抑制作用，且濃度與抑制率正相關(guān),說(shuō)明金龍魚(yú)食用油能明顯抑制銅綠微囊藻的正常生長(zhǎng).

表2 金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制率(%)Table 2 The inhibition ratio of the edible oil of Golden dragon fish on M.aeruginosa(%)

2.4金龍魚(yú)食用油抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的半抑制濃度

EC50按照第8天計(jì)算，由于只有金龍魚(yú)食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制率達(dá)到了50%以上，而其他5種食用油的抑制率并沒(méi)有達(dá)到50%，所以只計(jì)算金龍魚(yú)食用油的半抑制濃度，計(jì)算結(jié)果為4.18ml/L.

3 討論

脂肪酸是一類(lèi)重要的化感物質(zhì)，有很強(qiáng)的抑藻作用[11-12].但本研究所用的原料是6種食用油，由于食用油均為飽和或不飽和脂肪酸所形成的甘油三酯，相對(duì)來(lái)說(shuō)，游離的脂肪酸含量較低，其抑藻效果遠(yuǎn)不如游離脂肪酸的解釋可能是脂肪酸中的主要官能團(tuán)——羧基形成了酯鍵，使其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變，因此，本研究所得結(jié)果可為是利用脂肪酸還是利用其形成的酯類(lèi)化合物進(jìn)行抑藻提供理論參考.而在6種食用油中，其它5種食用油均為單一油類(lèi)，只有金龍魚(yú)食用調(diào)和油是多種油的復(fù)合制劑，相對(duì)來(lái)說(shuō)，其成分更多樣化，而且其脂質(zhì)中各種飽和程度不同的脂肪酸比例為飽和脂肪酸：?jiǎn)尾伙柡椭舅幔憾嗖伙柡椭舅崾?11，因此在對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用中，可能起到協(xié)同抑藻的效果，這一推測(cè)與張庭廷等[12]的研究結(jié)果相似.

此外，6種食用油均是從相應(yīng)植物體提取出來(lái)的含脂肪酸的脂類(lèi)物質(zhì)，將它們加入培養(yǎng)基之后，這種培養(yǎng)基物理性質(zhì)的改變，特別是其粘滯性對(duì)微囊藻的生長(zhǎng)基本不會(huì)產(chǎn)生多大影響(加入食用油的量較小)，而真正的影響可能來(lái)源于食用油中的脂肪酸對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生的一系列連鎖反應(yīng).

關(guān)于脂肪酸的抑藻機(jī)理也有一些報(bào)道.張庭廷等[11]認(rèn)為脂肪酸通過(guò)自由基的鏈鎖反應(yīng)，引起藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA的積累，大分子核酸或蛋白質(zhì)受到損傷，細(xì)胞膜通透性增加，葉綠素a合成減少，從而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞破裂死亡.Wu等[13]認(rèn)為脂肪酸改變?cè)寮?xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成K+外泄，誘發(fā)了對(duì)藻類(lèi)的抑制效應(yīng).Sokolov等[14]認(rèn)為脂肪酸改變了細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)或膜內(nèi)的離子通道，從而引起細(xì)胞死亡.Agafonov等[15]報(bào)道長(zhǎng)鏈C16-C22之間的飽和脂肪酸與Ca2+的親和作用引發(fā)了抑藻效應(yīng).Igarashi等[16]認(rèn)為脂肪酸通過(guò)Ca2+通道影響鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(CaM激酶)活性，進(jìn)而影響磷酸酶活性，最終抑制藻類(lèi)生長(zhǎng).

另外，食用油雖然能夠有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，但其效果卻不是最理想的.油脂類(lèi)在水體中的溶解性很低，即使加入量極少也會(huì)在水面出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，雖然是安全無(wú)毒害卻也影響水體環(huán)境的美觀.因此，以食用油抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)在實(shí)際應(yīng)用中將存在局限性.若想利用天然的油類(lèi)抑藻可能要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)處理，在保持其天然特性的同時(shí)使其游離脂肪酸增加，從而增加其抑藻效能，這也是今后需要進(jìn)一步探討的內(nèi)容.

然而，直接用食用油進(jìn)行抑藻的研究還是首次，本研究為利用脂肪酸及其脂類(lèi)抑藻提供了一些新的認(rèn)識(shí)和實(shí)驗(yàn)依據(jù).以食用油抑藻其優(yōu)點(diǎn)是成本相對(duì)較低，純天然，較人工合成的脂肪酸類(lèi)可能會(huì)對(duì)環(huán)境更友好.脂肪酸類(lèi)物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，有著很好的生態(tài)安全性.因此利用脂肪酸類(lèi)化感物質(zhì)的特性進(jìn)行抑藻，將對(duì)未來(lái)水華的治理有著重要意義.不足之處是耗損了糧食資源.同時(shí)，用脂肪酸抑藻時(shí)水體表面常有油狀物漂浮，影響景觀.如何才能減少食用油的使用，增加其溶解性，減少或消除其在水面的漂浮，提高其抑藻效果，這將是有待進(jìn)一步解決的問(wèn)題.

[1] 俞家祿，陳明惠，林坤.武漢東湖藍(lán)藻水華毒性研究(I)：淡水藍(lán)藻水華毒性檢測(cè)[J].水生生物學(xué)報(bào)，1987，11(3)：212-217.

[2] JIN Z H, ZHUANG Y Y, DAI S G, et al. Isolation and identification of extracts of Eich hornia crassipes and their alleopathic effects on algae[J]. Bull Environ Contam. Toxical, 2003,71:1048-1052.

[3] NEILAN B A, PEARSON L A, MUENCHHOFF J, et al. Environmental conditions that influence toxin biosynthesis in cyanobacteria[J]. Environmental Microbiology, 2013,15(5):1239-1253.

[4] NAKAI S, INOUE Y, HOSOMI M. Myriophyllum spicatum released allelopathic polyphe-nols inhibiting growth of blue-green algae Microcystis aeruginosa[J]. Water Res, 2000,34:3023-3026.

[5] RICE. Allelopathy[M]. The second edition. London:Academic Press, 1984：1-2.

[6] YASUSHI K, YASUNORI K, KYOJI S. Acute toxicity of fatty acids to the freshwater green-algal selenastrum capricornutum[J]. Environmental Toxicology, 2003,18：289-294.

[7] IKAWA M, HARSTSHORNE T, CARON LA, et al. Inhibition of growth of the green-alga Chlo-rella pyrenoidosa by unsaturated fatty acid [J]. Journal of the American Oil Che -mists’Society, 1984,61:1877-1878.

[8] ZHANG T T, HE M, WU A P, et al. Allelopathic effect of surbmerbed macrophyte Chara vulgaris on toxic Microcystis aeruginosa[J]. Allelopathy Journal, 2009,23(2):391-402.

[9] 周揚(yáng).可水培陸生植物大蔥化感抑藻效應(yīng)及其機(jī)理研究[D].蕪湖：安徽師范大學(xué)，2013：4-8.

[10] GNIAZDOWSKA A, BOGATEK R. Allelopathic interactions between plants,Multisite action of allelochemicals[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2005,27(3):395-407.

[11] 張庭廷，鄭春艷，聶劉旺，等.亞油酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制機(jī)理[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2009，29(4):419-424.

[12] 張庭廷，鄭春艷，何梅，等.脂肪酸類(lèi)物質(zhì)的抑藻效應(yīng)及其構(gòu)效關(guān)系[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2009，28(3):274-27.

[13] WU J T, CHIANG Y R, HUANG W Y, et al. Cytotoxic effects of free fatty acids on phytoplankton algae and cyanoact -eria[J]. Aquatic Toxicology, 2006,80:338-345.

[14] SOKOLOV Y, MARTIN D, LEHRER I, et al. Membrane channel formation by antimicrobial protegrins[J]. Biochimica et Biophysica acta, 1999,1420:23-29.

[15] AGAFONOV A, GRITSENKO E, BELOSLUDTSEV K, et al. A permeability transition in liposom-es induced by the formation of Ca2+/palmitic acid complexes[J]. Biophysica Acta, 2003,1609(2):153-160.

[16] IGARASHI T, ARITAKE S, YASUMOTO T. Mechanisms underlying the hemolytic and ichthy -otoxic activities of maitotoxin[J]. Natural Toxins, 1999,7:71-79.

TheInhibitionEffectsofSixKindsofEdibleOiltoMicrocystisAeruginosa

ZHANG Sheng-juan1, XIA Wen-tong2, YANG Xiao-hui3, ZHANG Ting-ting4

(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Through the determination of related parameters, such as algal density, inhibition rate and so on, this article respectively studied 6 kinds of common edible oil, for example, the golden dragon fish cooking oil, soybean oil, peanut oil, etc., in order to research their influence to the growth of microcystis aeruginosa Kutz. The experimental results show that the golden dragon fish oil can effectively inhibit the growth of Microcystis aeruginosa. Simultaneously, it also has obvious dose-effect relationship, time-effect relationship within a certain period of time. And the half inhibitory concentration (EC50) of 3.0×105cells/ml microcystin algae is up to 4.18ml/L.

microcystis aeruginosa; golden dragon fish oil; fatty acid; inhibitory effect on alga;

2014-05-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170443).

張勝娟(1985-)，女，河南民權(quán)人，碩士研究生.通訊作者：張庭廷(1955-)，女，安徽東至人，教授，博士.

張勝娟，夏文彤，楊曉輝，等.六種食用油對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，37(6)：564-568.

X524

：A

：1001-2443(2014)06-0564-05