非小細(xì)胞肺癌患者凝血功能異常的相關(guān)因素與預(yù)后分析

李艷華 魏素菊 王俊艷 洪雷 崔利格 王彩

近來研究越來越多地發(fā)現(xiàn)凝血功能紊亂通常是惡性腫瘤的首發(fā)跡象。Kalweit等[1]通過對供應(yīng)肺腫瘤的肺靜脈血和肺癌患者外周血進(jìn)行凝血纖溶指標(biāo)檢測，發(fā)現(xiàn)肺靜脈血中各項指標(biāo)明顯高于外周靜脈血，說明肺癌可直接激活凝血及纖溶系統(tǒng)。雖然臨床上血栓性疾病和彌散性血管性凝血（disseminated intravascular coagulation, DIC）僅發(fā)生于較少的癌癥患者，但是近些年的研究證實在肺癌患者中亞臨床的凝血纖溶指標(biāo)的改變尤為常見。因此，高血凝狀態(tài)越來越受到臨床醫(yī)師的重視，成為近期研究的熱點問題之一。

癌癥和凝血系統(tǒng)之間存在多個機制，這些機制證明了腫瘤生物學(xué)與凝血功能是緊密相連的過程[2]。最近的研究表明，癌癥患者的凝血異?？赡軐?dǎo)致了炎性細(xì)胞的募集、腫瘤間質(zhì)的產(chǎn)生和血管生成。腫瘤激活凝血系統(tǒng)增加了其侵襲與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。研究[3,4]表明高水平的循環(huán)生物標(biāo)志物，如活化凝血和纖溶系統(tǒng)的纖維蛋白原、纖維蛋白裂解產(chǎn)物和D二聚體（D-dimer, D-D）等與多種類型腫瘤生存率的下降密切相關(guān)。針對肺癌患者活化的凝血系統(tǒng)與預(yù)后之間關(guān)系的研究已經(jīng)揭示了相似的結(jié)果[5]。

肺癌是最常見的嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，本研究回顧性分析604例NSCLC患者凝血功能異常的相關(guān)臨床資料，探討凝血功能指標(biāo)的預(yù)后價值，為目前NSCLC患者高凝狀態(tài)的預(yù)防及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究收集2009年1月-2012年12月首次就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院的604例經(jīng)病理學(xué)證實的NSCLC患者的臨床資料。資料內(nèi)容包括患者治療前凝血功能相關(guān)指標(biāo)包括血漿凝血酶原時間（prothrombin time, PT）、凝血酶原活動度（prothrombin time activity,PTA）、國際標(biāo)準(zhǔn)化比率（international normalized ratio,INR）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time, APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen, Fib）、D-D、血小板計數(shù)（platelet count, PLT）、性別、年齡、病理分型、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)等。所有患者在就診前6個月內(nèi)無抗癌治療史。肺癌的病理學(xué)診斷根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）標(biāo)準(zhǔn)，分期根據(jù)修訂后的TNM肺癌分期[國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）2010分期標(biāo)準(zhǔn)]。本研究選擇了50例同期就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院的非癌癥患者作為對照組。

1.2 檢測方法和觀察指標(biāo) 采集治療前清晨空腹靜脈血，所用儀器為ACL TOP700凝血分析儀，PT、TT、APTT、Fib質(zhì)控血漿N.P均為美國獨立實驗室產(chǎn)品。PT正常值9 s-12 s；APTT正常值28 s-41 s；Fib正常值2.00 g/L-4.40 g/L，PTA正常值80%-160%；INR正常值0.8-1.4。D-D檢測采用干式免疫散射色譜法。所用儀器為NycoCard Reader II檢測試劑盒，D-D正常值0-1.00 mg/L。采用雅培全自動血細(xì)胞分析儀及配套試劑檢測PLT正常值100×109/L-300×109/L。

1.3 隨訪 隨訪方式主要為電話、門診及住院等，所有患者隨訪至2013年12月31日，隨訪時間最短為2個月，最長為60個月，中位隨訪時間為21個月?？偵嫫冢╫verall surivival, OS）是指從病理確診時間至患者死亡時間。隨訪期間死于其他原因、失訪或研究截止時仍生存者，均記為截尾值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)描述，組間比較采用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U檢驗）；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線；生存率比較采用Log-rank檢驗；多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本研究包括604例NSCLC患者。其中385例死亡（64%），58例失訪（9.6%）。其中男性409例（68%），女性195例（32%）；中位年齡60（22-86）歲，其中≥65歲的患者187例（31%），＜65歲的患者417例（69%）。腺癌370例，鱗癌234例；I期-IIIa期250例，IIIb期-IV期354例。I期86例，II期59例，IIIa期105例，IIIb期82例，IV期272例；N0者213例，N1-N3者391例。

2.2 NSCLC患者凝血指標(biāo)與對照組比較 NSCLC患者與對照組之間所有的凝血功能指標(biāo)（包括PT、PTA、INR、APTT、Fib、D-D、PLT）的血漿水平顯示均有統(tǒng)計學(xué)差異[除了Plt（P=0.004,5）、Fib（P=0.001,5），其余指標(biāo)P＜0.001）]（表1）。NSCLC患者組較對照組PT、INR明顯延長，APヰ縮短，F(xiàn)ib、D-D、Plt水平明顯升高。

2.3 NSCLC患者凝血指標(biāo)與其臨床病理特征的關(guān)系（表2）

2.3.1 凝血功能與NSCLC患者性別之間的關(guān)系 男性較女性患者相比PT、APTT和INR延長（P=0.007，P＜0.001和P=0.013,5），PTA下降（P=0.002,5），F(xiàn)ib升高（P＜0.001），這表明與女性患者相比，男性患者有更高的活化凝血級聯(lián)反應(yīng)的趨勢。不同性別組的D-D與PLT水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.2 凝血功能與NSCLC患者年齡之間的關(guān)系 不同年齡組的凝血功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.3 凝血功能與NSCLC患者組織學(xué)分型之間的關(guān)系 NSCLC患者中鱗癌比腺癌的Fib水平顯著升高（P＜0.001），PT、INR下降（P=0.006,5； P=0.008,5），PTA升高（P=0.002,5）。不同組織學(xué)分型組的APTT、D-D差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.4 凝血功能與NSCLC患者TNM分期之間的關(guān)系NSCLC患者中III期、IV期比I期-II期的Fib、PLT升高（P＜0.001, P=0.014），APTT明顯縮短（P＜0.001）。不同分期組的PT、PTA、INR、D-D則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.5 凝血功能與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間的關(guān)系 N1-N3的患者與N0患者相比，APTT明顯縮短（P＜0.001），F(xiàn)ib、D-D水平升高（P＜0.001； P=0.048）；而同時PT、INR延長，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.124；P=0.295）。不同淋巴結(jié)狀態(tài)組的PTA、PLT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 NSCLC患者的生存分析

2.4.1 生存率的比較（表3） 本研究604例患者的中位生存期為17月。通過Log-rank生存比較研究表明，PT、INR延長（P=0.032； P=0.001），PTA下降（P=0.005），F(xiàn)ib明顯升高（P＜0.001），在統(tǒng)計學(xué)上對總生存有不利影響（圖1-圖3）。盡管APTT和D-D水平高于中位數(shù)的患者與低于中位數(shù)的患者相比，生存率有下降的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.20； P=0.105）。不同的年齡、性別及組織學(xué)分型則對生存的影響無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4.2 多因素生存分析 多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險回歸分析（表4）。P≤0.05的主要變量（包括TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、INR、PTA和Fib）被納入了分析；PT被排除是由于PT與INR的高度相關(guān)性。因此，除了TNM分期，只有延長的INR與較差的預(yù)后獨立相關(guān)（TNM分期：HR=6.942，P=0.007；INR：HR=1.666，P=0.017）。

表1 NSCLC肺癌患者與對照組之間凝血功能指標(biāo)的比較Tab 1 The values of serum coagulation tests in patients with NSCLC and controls

表2 NSCLC患者凝血指標(biāo)與其臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Results (median) of comparisons between the coagulation tests and various clinical and pathological characteristic

3 討論

現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識到癌癥患者中存在凝血系統(tǒng)的激活，這通常反映了常規(guī)凝血指標(biāo)的亞臨床異常改變。盡管許多研究討論了惡性腫瘤患者血液高凝狀態(tài)和血栓栓塞并發(fā)癥的原因，但是機制仍然沒有完全闡明。一些研究證明腫瘤細(xì)胞激活凝血和纖溶系統(tǒng)，有助于侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，在一些惡性腫瘤中（例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌），這種激活的程度與腫瘤的分期及預(yù)后密切相關(guān)[6]。在肺癌患者中，存在著持續(xù)的凝血刺激。肺癌患者存在凝血功能紊亂，這不僅與腫瘤的生長、浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移以及并發(fā)靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism, VTE）等密切相關(guān)，還直接影響肺癌患者的預(yù)后。

無論是由于癌癥本身還是治療措施所致，癌癥中經(jīng)常存在凝血激活，典型的表現(xiàn)如VTE和低水平的DIC。Armand Trousseau教授于1865年首先報道了惡性腫瘤與血栓形成的相關(guān)性，腫瘤患者體內(nèi)往往呈高凝狀態(tài)，有并發(fā)血栓性疾病的潛在風(fēng)險。迄今已有大量文獻(xiàn)[7]報道惡性腫瘤患者存在凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)功能的異常，這種異常不僅導(dǎo)致患者的血栓或出血癥狀，還與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及血管新生等過程密切相關(guān)，而且與惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)。

高血凝狀態(tài)是指血液發(fā)生易于形成血栓的病理生理的變化。具體表現(xiàn)包括：①凝血因子及纖維蛋白原合成增多或功能亢進(jìn)；②纖溶及抗凝系統(tǒng)各蛋白或因子的合成減少、消耗增多或功能減弱；③血小板增多或功能亢進(jìn)；④血管壁的損傷，啟動血管內(nèi)皮細(xì)胞；⑤血液粘滯度較前增高。在這種病理狀態(tài)下，有助于血栓形成，若在這個時期根據(jù)某些指標(biāo)的改變，早期明確血栓前狀態(tài)，采取適當(dāng)?shù)拇胧?，可能有助于改善疾病的預(yù)后。

表3 單因素生存分析Tab 3 Univariate survival analysis results for coagulation tests and clinical and pathological characteristic

本研究也證實了在非癌癥患者對照組與NSCLC患者組中凝血功能指標(biāo)水平存在明顯的差別（P＜0.01）。在本研究中，由于凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，患者組與對照組相比D-D值升高（P＜0.001）。盡管癌癥中凝血功能的激活機制是多因素的，但是組織因子（tissue factor, TF）在這一過程中起重要作用。癌細(xì)胞TF表達(dá)水平的升高以及血小板、單核細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞釋放TF，這都是促凝血活動的主要來源[8]。由這種跨膜糖蛋白啟動的凝血級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)了一系列事件，進(jìn)而將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，產(chǎn)生不溶性的纖維凝塊。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者中鱗癌比腺癌的Fib水平升高（P＜0.001），與相關(guān)研究[9]結(jié)果一致。本研究表明，NSCLC患者不同TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的APTT、 Fib水平具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。而研究[10]表明不同TNM分期和病理類型的肺癌患者的Fib和D-二聚體水平未見明顯差異。現(xiàn)在許多研究對凝血功能指標(biāo)如PT、APTT、D-二聚體和Plt等與肺癌患者病理分型、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和TNM分期等的關(guān)系進(jìn)行了分析，但結(jié)論仍有所爭議，需多中心大樣本的研究進(jìn)一步證實。

圖1 不同PT水平NSCLC患者的總生存曲線Fig 1 Overall survival curves in patients with NSCLC according to PT levels (P=0.032)

圖2 不同INR水平NSCLC患者的總生存曲線Fig 2 Overall survival curves in patients with NSCLC according to INR levels (P=0.001)

圖3 不同纖維蛋白原水平NSCLC患者的總生存曲線Fig 3 Overall survival curves in patients with NSCLC according to fibrinogen levels (P＜0.001)

血液凝固是由許多凝血因子參與的、復(fù)雜的蛋白質(zhì)酶解過程，包括內(nèi)源性和外源性兩條途徑。APTT、PT是主要反映內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)各凝血因子的含量與活性的指標(biāo)。內(nèi)源途徑是血液通過接觸帶負(fù)電荷的異物表面而啟動，而外源途徑通過TF觸發(fā)其級聯(lián)反應(yīng)，其機制可能為TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等大量表達(dá)TF[11]，從而激活相關(guān)凝血因子形成復(fù)合物，從而使患者機體的血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為血栓前狀態(tài)，繼而形成血栓。研究[12]顯示，PT的延長與NSCLC較差的預(yù)后密切相關(guān)，但是在這個研究中多變量模型沒有證實凝血因子的預(yù)后相關(guān)性。本研究在單因素分析中也揭示了PT和INR延長的意義，在多因素生存分析中顯示INR是肺癌的獨立預(yù)后因素（P=0.017），與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，在不遠(yuǎn)的將來PT、INR可能成為NSCLC預(yù)后指標(biāo)。

纖溶系統(tǒng)的亢進(jìn)也是高凝狀態(tài)的重要的反應(yīng)。Fib和D-D是反映體內(nèi)存在纖溶亢進(jìn)及高凝狀態(tài)的較為特異性的指標(biāo)。Fib由肝臟產(chǎn)生，是血漿中含量最高的凝血蛋白，被激活后轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白多聚體，交聯(lián)各種血細(xì)胞形成血凝塊，保護循環(huán)中的癌細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的殺傷，從而增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛能，同時又可通過血小板膜表面糖蛋白介導(dǎo)激活血小板。D-D是交聯(lián)的纖維蛋白裂解產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，其存在表明體內(nèi)有纖維蛋白形成和溶解。

在一項肺癌轉(zhuǎn)移研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原缺陷小鼠的肺部和局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率均低于野生型小鼠，而兩種小鼠的血管生成及腫瘤的生長沒有明顯差異[14,15]。而另有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過合成纖維蛋白原，并與成纖維細(xì)胞生長因子相互作用來促進(jìn)腫瘤的生長[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者Fib和D-D水平升高（P＜0.001），表明機體存在纖溶亢進(jìn)和高血凝狀態(tài)，有利于血栓形成，這與相關(guān)的研究是一致的[17,18]。腫瘤可激活血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶抑制劑，從而抑制纖維蛋白的降解[19]。在本研究[20]中，高纖維蛋白原水平的患者生存率下降（P＜0.001）。這個結(jié)果與最近的一項研究相一致的，該研究報告了在結(jié)直腸癌中極高纖維蛋白原水平與較短的DFS之間的相關(guān)性?，F(xiàn)在許多研究[21-24]已經(jīng)證實，D-D的升高是NSCLC預(yù)后差的重要預(yù)測標(biāo)志物。在本研究中D-D水平升高的患者有生存期下降的趨勢，但是沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.105）。

血小板是骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞漿裂解脫落的活性胞質(zhì)小塊，具有粘附、聚集和釋放的功能，直接參與血栓形成并在血栓形成過程中起關(guān)鍵性作用。研究[25]發(fā)現(xiàn)血小板增多存在于30%-60%的腫瘤患者中，肺癌患者血小板增多較普遍。我們研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者PLT水平較對照組升高（P=0.001,5）；PLT水平高于中位數(shù)的患者其生存率有下降的趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.156）。血小板通過釋放其顆粒中的各種生長因子和趨化因子（如VEGF、PDGF、IGF-1等），而上調(diào)其它促血管新生介質(zhì)的表達(dá)，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子CXCL12、MMP-1、MMP-2和MMP-9等，增加血管生成，促進(jìn)腫瘤的生長[26,27]。腫瘤細(xì)胞所致的血小板聚集高度支持腫瘤轉(zhuǎn)移[28]。PLT可通過蛋白酶類、白介素、凝血酶等介導(dǎo)產(chǎn)生，而激活的PLT有更強的粘附性和聚集性，提高血液凝固性，使機體處于高血凝狀態(tài)，導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生率增加。

肺癌患者常伴凝血及纖溶功能的異常，使機體內(nèi)存在高凝狀態(tài)，有利于血栓的形成。因此，對肺癌患者檢測血漿中凝血及纖溶指標(biāo)，早期發(fā)現(xiàn)血液高凝狀態(tài)，及早采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧?，對避免VTE的發(fā)生及肺癌的預(yù)后可能有重要的臨床意義。