健脾益肺解毒方對肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響※

● 單愛云 曹 勇 馬玉玲 曾秀娣 劉 敏 王莎莎

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健脾益肺解毒方對肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響※

● 單愛云1曹 勇2▲馬玉玲2曾秀娣2劉 敏2王莎莎2

目的：探討健脾益肺解毒方藥物血清對肺癌耐藥細胞周期的影響。方法：將細胞分為荷瘤動物藥物血清大、中、小劑量組，模型組，順鉑(DDP)組，維拉帕米(VRP)組，大、中、小劑量分別加DDP組和加VRP組。采用血清藥理學及流式細胞術，觀察健脾益肺解毒方藥物血清分別與DDP和VRP合用后，對A549/DDP細胞周期的作用。結果：健脾益肺解毒方藥物血清合用DDP和VRP后能協(xié)同DDP和VRP增加A549/DDP細胞G0/G1期細胞數(shù)，減少S期細胞比例(P<0.05)。結論：健脾益肺解毒方藥物血清能協(xié)同DDP和VRP阻滯A549/DDP細胞于G0/G1期，阻止A549/DDP細胞DNA的合成，抑制肺癌耐藥細胞的分裂增殖。

健脾益肺解毒方 細胞周期 A549/DDP細胞

健脾益肺解毒法是臨床治療肺癌的常用方法，臨床發(fā)現(xiàn)健脾益肺解毒方藥對肺癌中晚期和放化療后均有確切的療效，具有減輕化療藥物毒副反應、提高臨床療效、改善臨床癥狀、提高生活質量、延長生存期作用，尤其對肺癌化療前后及康復期配合健脾益肺解毒中藥，療效尤為明顯。并且實驗研究證實健脾益肺化瘀方對動物移植性肺癌具有抑瘤和化療協(xié)同增效作用[1]。為了進一步明確健脾益肺解毒方對肺癌的作用，應用藥物血清法，觀察由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、仙鶴草等單味中藥免煎顆粒組成的健脾益肺解毒方對人肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響，以探討健脾益肺解毒方對肺癌耐藥細胞的作用機制。

1 材料

1.1藥物健脾益肺解毒方免煎顆粒劑(由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、茜草、仙鶴草等單味中藥免煎顆粒劑組成)，深圳三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。用溫蒸餾水配成相當于原生藥材2g/ml的濃縮劑，置4℃冰箱備用。順鉑(DDP)，錦州九泰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10mg/瓶，批號050502；青霉素，哈藥集團制藥總廠生產(chǎn)，100萬單位/瓶，批號0101002；鏈霉素，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，100萬單位/瓶，批號0101002；維拉帕米(VRP)，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，2ml/5mg，批號4E12001。

1.2動物SPF級C57BL/6J小鼠，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0002。

1.3瘤株Lewis肺癌，由廣州中醫(yī)藥大學腫瘤研究所提供；人肺腺癌耐藥細胞系A549/DDP，由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸病研究所吳國明教授惠贈。

1.4試劑RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，GIBCO；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，GIBCO。

1.5儀器超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；CO2孵箱，Thermo Forma；96孔平底細胞培養(yǎng)板，Corning；FACSCalibur流式細胞儀，美國BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫爾特)公司；倒置顯微鏡，Nikon；電子天平，F(xiàn)A2004型，Sartorius，德國。

2 方法

2.1荷瘤動物藥物血清制備取健康C57BL/6J小鼠40只，體重18～22g，每鼠右前肢腋部皮下注射0.2ml小鼠Lewis肺癌組織懸液，24h后隨機分為健脾益肺解毒方大、中、小劑量組和模型空白對照組，每組10只。健脾益肺解毒方大劑量組、中劑量組、小劑量組分別按30g·kg-1、20g·kg-1、10g·kg-1灌胃給藥(分別為臨床成人日用量的19.0倍、12.8倍和6.4倍)，模型對照組以等容積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)10d，末次灌胃1h，腹主動脈采血，無菌分離血清，經(jīng)56℃30min滅活處理后，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細胞培養(yǎng)復蘇后的人肺腺癌耐藥細胞系A549/DDP，接種于50ml培養(yǎng)瓶，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100IU·ml-1)6ml，置于37℃、飽和濕度含5%CO2和95%空氣的CO2孵箱中無菌培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，每2～3天更換培養(yǎng)液。

2.3細胞懸液的制備取對數(shù)生長期A549/DDP細胞，加入適量的0.25%胰蛋白酶液消化，PBS洗滌2次，離心，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成2×105·ml-1細胞懸液。

2.4肺癌耐藥細胞周期測定采用流式細胞術法。取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞，0.25%胰蛋白酶消化計數(shù)，以2×105·ml-1的量接種于培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2培養(yǎng)24h，至細胞生長旺盛貼壁后，去掉培養(yǎng)液，換成不含胎牛血清的培養(yǎng)液。而后將細胞分為荷瘤動物藥物血清大劑量組(簡稱大劑量組)，荷瘤動物藥物血清中劑量組(簡稱中劑量組)，荷瘤動物藥物血清小劑量組(簡稱小劑量組)，荷瘤動物模型血清組(簡稱模型組)，A549/DDP組(DDP組)，維拉帕米(VRP)組，大、中、小劑量分別加DDP組和大、中、小劑量分別加VRP組。大、中、小劑量組分別加入300μl終濃度為10%的不同劑量組含中藥荷瘤動物血清；模型組加入終濃度為10%的荷瘤動物模型血清300μl；DDP組只加入終濃度為1μg·ml-1的DDP 300μl；大、中、小劑量分別加DDP組，同時加入300μl終濃度10%的不同劑量組含中藥荷瘤動物血清和恒定濃度為1μg·ml-1的DDP各300μl；VRP組只加入終濃度為10μg·ml-1的VRP300μl；大、中、小劑量分別加VRP組，同時加入300μl終濃度10%的不同劑量組含中藥荷瘤動物血清和恒定濃度為10μg·ml-1的VRP各300μl；每瓶終體積為3ml，不足部分加以RPMI-1640培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后分別離心，用PBS洗滌2次，制成細胞懸液。

收集不同因素處理的106個細胞，離心后PBS液洗滌，加入冰冷的70%乙醇固定，PBS液洗滌，加入PI熒光染液(50μg·ml-1PI，l0μg·ml-1RNA酶)4℃避光孵育30min，流式細胞儀分析DNA熒光強度，在流式細胞儀測定細胞的熒光強度，資料經(jīng)計算機多正態(tài)擬合分析，得出細胞群體在細胞周期各個時相的分布比例。

3 結果

3.1健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清對肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響結果顯示，DDP組及健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清大劑量組A549/DDP G1期細胞比例明顯高于模型組(P<0.01)，而中、小劑量組無明顯變化(P>0.05)。DDP組及健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清各劑量組A549/DDP S期細胞比例均明顯低于模型組(P<0.01)；與DDP組相比，健脾益肺解毒方大劑量組G1期比例無明顯變化(P>0.05)，中、小劑量組G1期比例明顯低于DDP組(P<0.01)，而健脾益肺解毒方各劑量組S期比例均明顯高于DDP組(P<0.01)，且健脾益肺解毒方在S期細胞分布高于G0/G1。見表1。

表1 健脾益肺解毒方藥物血清對A549/DDP耐藥細胞周期的影響

注：與模型組比較，1)P<0.01；與DDP組比較，2)P<0.01

3.2健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清與DDP合用時對肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響結果顯示，健脾益肺解毒方藥物血清各劑量組與DDP合用后，肺癌耐藥細胞A549/DDP G1期比例均明顯高于模型組和DDP組(P<0.01)，S期細胞比例均明顯低于模型組和DDP組(P<0.01)。見表2。

表2 健脾益肺解毒方藥物血清與DDP合用時對A549/DDP耐藥細胞周期的影響

注：與模型組比較，1)P<0.01；與DDP組比較，2)P<0.01

3.3健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清與VRP合用時對肺癌A549/DDP耐藥細胞周期的影響結果顯示，VRP及健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清合用VRP后，各組A549/DDP G0/G1期細胞比例均明顯高于DDP組(P<0.01)，S期細胞比例均明顯低于DDP組(P<0.01)；健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清大、中、小劑量組合用VRP后，大、中劑量組A549/DDP G1期細胞比例均高于VRP組(P<0.05)，健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清各劑量組S期細胞比例均明顯低于VRP組(P<0.01)。見表3。

表3 健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清與VRP合用時對A549/DDP耐藥細胞周期的影響

注：與DDP組比較，1)P<0.01；與VRP組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

4 討論

化療耐藥是肺癌治療不理想的原因之一。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，肺癌中晚期和化療后均有肺脾虛損的表現(xiàn)，尤其是肺癌化療后尤為突出。我們根據(jù)中醫(yī)五行相生理論，脾屬土，肺屬金，對肺癌化療和中晚期采用健脾益肺為主以達培土生金，化瘀解毒為輔以治肺之癌瘤，收到了較好的臨床效果。健脾益肺解毒方由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、仙鶴草等藥組成?，F(xiàn)代藥理學研究證明黃芪多糖可預防及減輕化療后骨髓抑制，黨參多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用，黃芪可明顯抑制人肺癌細胞增殖，減少肺癌小鼠肺部轉移，延長生存期，提高體內(nèi)免疫功能[2-4]。豬苓多糖主要通過抗氧化、清除自由基，抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡，影響腫瘤基因表達和增強免疫功能等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。中藥半枝蓮有抗突變、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、免疫增強、抗氧化、抑制端粒酶活性、抑制腫瘤血管生成等作用[6]。仙鶴草不論是對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，還是實驗動物移植性腫瘤均有抑制或殺傷作用，尤其是在抑制瘤體增殖，促進癌癥患者康復，改善臨床癥狀，減輕放化療的毒副作用，提高生存質量，阻止癌前病變，以及提高機體免疫功能等諸多方面，均有明顯的效果[7]。表明健脾益肺解毒方的藥物組成不但符合中醫(yī)的組方原則，而且具有現(xiàn)代藥理基礎。

以南京寧蕪鐵路部分節(jié)點為例，結合綠道系統(tǒng)的打造，將原有跨內(nèi)秦淮河的鐵路橋保留再利用，改造成為慢行專用橋，串聯(lián)起河道兩側的慢行空間，由此既落實了“面”與“線”層面城市綠道系統(tǒng)的構建要求，同時也提升了跨河慢行聯(lián)系的連續(xù)性與安全性。

細胞周期反映了細胞的增殖過程，細胞周期長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細胞周期延長，增殖分裂減慢。惡性腫瘤的本質在于細胞周期的調節(jié)失控，出現(xiàn)無限制細胞增殖和分裂?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，細胞周期的調控異常導致細胞的失控性增殖，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要特征，幾乎所有的腫瘤都有細胞周期調控機制的破壞導致細胞生長失控、分化受阻、凋亡異常的特征[8]。

本研究結果顯示，健脾益肺解毒方在S期細胞分布高于G0/G1，表明單用健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清不能阻滯A549/DDP細胞于G0/G1，從而使進入S期的細胞增加，對肺癌耐藥細胞A549/DDP增殖無抑制作用。但是健脾益肺解毒方藥物血清與DDP合用后，A549/DDP G1期比例均明顯高于DDP組，S期細胞比例均明顯低于DDP組，表明健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清與DDP合用后，具有協(xié)同DDP阻滯肺癌A549/DDP耐藥細胞于G0/G1期，減少增殖細胞在S期的分布，從而減少肺癌細胞在S期DNA的合成，抑制肺癌耐藥細胞增殖，逆轉肺癌A549/DDP耐藥細胞的耐藥性，增強化療敏感性。

維拉帕米(VRP)是一種鈣通道阻滯劑，能與P-糖蛋白(P-gp)結合，抑制細胞毒性藥物外排，使細胞內(nèi)化療藥物濃度升高，細胞毒效應增強，對多藥耐藥具有逆轉作用，極大地增加了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[9]。研究結果顯示，健脾益肺解毒方藥物血清與VRP合用后，A549/DDP G1期比例均明顯高于VRP組，S期細胞比例均明顯低于VRP組。說明健脾益肺解毒方荷瘤動物藥物血清與VRP合用后，能協(xié)同增強VRP阻滯肺癌耐藥細胞A549/DDP于G0/G1期，減少增殖細胞在S期的分布，從而抑制肺癌耐藥細胞周期的增殖。由此認為健脾益肺解毒方藥物血清抑制肺癌耐藥細胞周期增殖的機理可能與增強細胞鈣通道阻滯作用密切相關。

[1]孟 華，曹 勇，夏清華.健脾益肺化瘀方對小鼠Lewis肺癌作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007(1)：11-12.

[2]鄭召鵬，楊衛(wèi)兵，李 寧，等.注射用黃芪多糖預防非小細胞肺癌化療后骨髓抑制的療效觀察[J].中草藥，2013，44(2)：208-209.

[3]楊 瑾，袁德培，陳龍全，等.黨參多糖類成分抗腫瘤活性的研究進展[J].湖北民族學院學報(醫(yī)學版)，2011，28(3)：67-68.

[4]吳朝妍，張瑩雯，葉太生，等.NF-κB抑制介導的黃芪多糖抗人肺癌細胞效應[J].武漢大學學報(醫(yī)學版)，2013，34(2)：174-177.

[5]劉洪超，蔡林衡，王淑英.豬苓多糖抗腫瘤機制研究進展[J].河南科技大學學報(醫(yī)學版)，2011，29(3)：236-238.

[6]牛國曉，李 潔.半枝蓮抗腫瘤機制研究進展[J].腫瘤防治研究，2012，39(2)：231-233.

[7]巴曉雨，何永志，路 芳，等.仙鶴草研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13(5)：258-261

[8]王 昕.細胞周期調控與腫瘤發(fā)生的研究[J].中國民康醫(yī)學，2010，22(16)：2135-2136.

[9]李小兵.靶動脈灌注維拉帕米聯(lián)合化療藥物介入治療晚期肺癌的臨床療效分析[J].實用心腦肺血管病雜志，2013，21(12)：130-131.

中醫(yī)故事

郎中對對子

民國時期，有個縣太爺自以為是天下奇才，喜歡與人比詠詩作對。有一天下雨，縣太爺硬要一個看病的郎中與他對對子。郎中無奈，也只好硬著頭皮，等著縣太爺出題。

縣太爺以郎中打著的雨傘為題，道出一聯(lián)：黑柄雙雨傘；

郎中不會對對子，只好順口打哇哇：銀翹八寶盤。

縣太爺說：“我出的上聯(lián)是物件，你對的下聯(lián)是藥名，藥名對物件……，嗯，馬馬虎虎。好!我再出一聯(lián)你對對看。”說完，眼一瞄，見前面裁縫鋪里師傅正拿著尺量布，就以其為題，道出一聯(lián)：三尺天青緞；

郎中三句不離本行，又隨口對出：六味地黃丸。

縣太爺說：“你又是對的藥名吧？你光對藥名，我又不曉得到底有這些藥名沒有。這樣吧，我再出一聯(lián)，我以什么為題，你就以什么來對?！彼f罷，頭一偏，見路旁一戶人家有個丫頭正倚在門旁歪著腦袋朝外看人，就以這個丫頭為題，搖頭晃腦道出一題：小女子，紅光滿面，定知三從四德；

郎中心想：我對藥，你又說不行；你看見人就出題，我又到哪里去找人來對呀？他愁眉苦臉地望著縣太爺，驀地心里一亮，有了，面前這位縣太爺不是人嗎？只見他盯著縣太爺，察言觀色，一字一句地說：大老爺，面黃肌瘦，必有五癆七傷。

縣太爺正要發(fā)作，但轉念一想，是自己出題要他對的，而且對得又工穩(wěn)，真是啞巴吃黃連，有苦說不出?？伤€是忍不住罵了聲：小奴才!

郎中以為這又是縣太爺出的上聯(lián)，便脫口而出：大老爺!

縣太爺面紅耳赤，惱羞成怒，朝郎中大聲呵斥：該死!

郎中還是以為縣太爺在出對，又連忙對出下聯(lián)：無救!

廣東省科技計劃項目(No.73062)；廣州市科技計劃項目(No.2007Z3-E5091)。

曹勇，男，教授。研究方向：中醫(yī)腫瘤防治。E-mail:tcaoy@163.com。

1.廣東省深州市福田區(qū)中醫(yī)院(518034)；2.暨南大學醫(yī)學院中醫(yī)系(510632)

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