果蠅白眼基因與小翅基因遺傳距離的測(cè)定*

李國(guó)泰

(通化師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002)

果蠅(Drosophilamelanogaster)是昆蟲(chóng)綱雙翅目果蠅科果蠅屬昆蟲(chóng).果蠅是遺傳學(xué)研究中重要的實(shí)驗(yàn)材料，果蠅有飼養(yǎng)方便，來(lái)源非常廣泛，生活周期短，繁殖率高，性狀容易觀察等優(yōu)點(diǎn)，果蠅現(xiàn)在已經(jīng)成為遺傳學(xué)研究中的模式生物.果蠅是完全變態(tài)昆蟲(chóng)，完成一個(gè)生活周期要經(jīng)歷四個(gè)階段：卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng).果蠅生活最適溫度是20～25℃，在最適溫度完成一個(gè)生活周期需要12～15d，果蠅的生活史與溫度有關(guān)，溫度超過(guò)30℃，會(huì)使雌果蠅的繁殖率下降或者不育，也有可能引起果蠅死亡，如果把溫度降到10℃果蠅的生活周期將要延長(zhǎng)到50d左右.

目前對(duì)于果蠅的研究在各個(gè)領(lǐng)域取得了不同程度的進(jìn)展，如：黑腹果蠅基因組已在2000年就完成了測(cè)序，為昆蟲(chóng)靶標(biāo)性的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).美國(guó)康奈爾大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)，果蠅在飛行時(shí)僅需要保證肌肉機(jī)械運(yùn)動(dòng)的同時(shí)改變翅膀傾斜的角度即可，該研究將有利于開(kāi)發(fā)出體積更小，機(jī)動(dòng)性更好的微型飛行器；摩爾根也是通過(guò)果蠅的研究發(fā)現(xiàn)了許多遺傳學(xué)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)的這些遺傳規(guī)律，對(duì)其它動(dòng)物、對(duì)人類(lèi)也同樣適用.另外科學(xué)家不僅用果蠅證實(shí)了孟德?tīng)柖啥疫€發(fā)現(xiàn)了果蠅白眼突變的性連鎖遺傳，提出了基因在染色體上直線排列以及連鎖交換定律[1]. 通過(guò)對(duì)白眼基因與小翅基因遺傳距離的研究可以為果蠅X染色體上基因定位提供理論依據(jù)，也可以為果蠅基因的研究提供數(shù)據(jù)參考．

1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型的果蠅眼睛為紅色，翅膀正常為長(zhǎng)翅，剛毛為直剛毛；白眼果蠅為突變型，眼睛為白色，翅膀?yàn)樾〕?

2 實(shí)驗(yàn)方法及處理過(guò)程

2.1 果蠅飼養(yǎng)

果蠅經(jīng)常在果園和水果上見(jiàn)到所以得名，腐爛的水果上常滋生酵母菌，果蠅以酵母菌做為食物，大多數(shù)能做為酵母菌發(fā)酵的基質(zhì)都可以作為果蠅培養(yǎng)基.

(1)果蠅培養(yǎng)基的配制．目前常用的果蠅培養(yǎng)基配方如表1所示.

表1 果蠅培養(yǎng)基的成分(100ml)

配制時(shí)將水分成兩份每份40ml，其中一份用于加熱溶解瓊脂及紅糖，另一份用來(lái)煮葡萄汁，將兩份分別溶解煮好，然后再將兩份合到一起煮沸，關(guān)掉火后再加少量丙酸，此時(shí)培養(yǎng)基很粘稠，要充分?jǐn)嚢瑁缓笤俜盅b培養(yǎng)瓶.等到培養(yǎng)基冷卻之后，在培養(yǎng)基表面撒上一層干酵母粉，然后塞上棉賽，為防止污染[2].

(2)滅菌.經(jīng)常用來(lái)培養(yǎng)果蠅用的是廣口瓶和指管.通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)和所需要果蠅的數(shù)量來(lái)決定采用哪種規(guī)格的培養(yǎng)瓶.本實(shí)驗(yàn)用的是80ml廣口瓶做培養(yǎng)瓶.培養(yǎng)瓶在使用之前要進(jìn)行滅菌.培養(yǎng)瓶滅菌前要先把手進(jìn)行消毒，用酒精擦拭手，然后用鑷子夾著酒精棉擦拭培養(yǎng)瓶，一般要求要消毒兩遍，擦完后要等待干燥了再用.

(3)原種的飼養(yǎng)．實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)白眼小翅果蠅，一般要培養(yǎng)9～12d，溫度為26℃，溫度不能太高，也不能太低，溫度太低果蠅不易羽化，等到化蛹之后，去掉培養(yǎng)瓶中的果蠅，從新羽化的果蠅中選擇處女蠅作雜交親本[3].

2.2 選擇處女蠅

從去掉培養(yǎng)瓶中的果蠅到選擇處女蠅通常需要9h左右，先把培養(yǎng)瓶中的果蠅全部去除，大約9h左右收集新羽化的果蠅，區(qū)分雌雄，通常雄蠅個(gè)體較小，腹部條紋大多為三條，腹部末端呈圓形，有性梳，而雌果蠅個(gè)體較大，腹部條紋多為五條，腹部末端尖，沒(méi)有性梳，從新羽化的果蠅中挑選出的雌蠅就是處女蠅，在選擇處女蠅應(yīng)特別注意要在雌果蠅從羽化開(kāi)始10h之內(nèi)選擇，因?yàn)樵?0h之內(nèi)新羽化的雌果蠅還沒(méi)達(dá)到性成熟，不具備交配能力，如果超過(guò)10h雌果蠅有可能已經(jīng)不再是處女蠅，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，所以雌性果蠅必須是處女蠅，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[4].

2.3 親本雜交

把選好的處女蠅(白眼小翅)和做為父本的雄蠅放入同一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，貼上標(biāo)簽，注明雜交的親本類(lèi)型，雜交的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)者的姓名，把培養(yǎng)瓶放在溫箱中培養(yǎng)，溫度一般為26℃，培養(yǎng)過(guò)程中要在2～4d內(nèi)觀察親本生活的狀況，如果出現(xiàn)了問(wèn)題，可以及時(shí)補(bǔ)救，以防影響實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，親本一般需要培養(yǎng)9～12d左右，培養(yǎng)到9d時(shí)，要隨時(shí)觀察果蠅的生長(zhǎng).

2.4 去除親本

果蠅雜交以后，在培養(yǎng)瓶中開(kāi)始有幼蟲(chóng)和蛹出現(xiàn)，要隨時(shí)觀察蛹的情況，等到蛹的外殼開(kāi)始變黑，這時(shí)果蠅就要羽化出來(lái)了，等到蛹即將羽化時(shí)，要把親本放掉，以免與新羽化的果蠅進(jìn)行雜交，新羽化的和原來(lái)的親本相混，去親本時(shí)，一定要去除干凈，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5].

2.5 觀察子一代果蠅的性狀

經(jīng)過(guò)4～5d左右，子一代果蠅羽化出來(lái)觀察果蠅與理論是否相符，本實(shí)驗(yàn)中子一代果蠅雌性全部是白眼小翅，觀察結(jié)果與理論相符合，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.6 測(cè)交

用子一代中雌性果蠅和雄性果蠅進(jìn)行雜交，通常選6對(duì)果蠅放入一個(gè)新培養(yǎng)瓶中，貼好標(biāo)簽，做好標(biāo)注，放入溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度一般為26℃.

2.7 去除親本

果蠅培養(yǎng)到7～8d以后，這時(shí)如果培養(yǎng)瓶中有足夠的幼蟲(chóng)和蛹的時(shí)候再放掉親本，等到蛹?xì)ぷ兒诘臅r(shí)候，說(shuō)明果蠅即將羽化出來(lái)，所以在去除親本的時(shí)候，一定要密切觀察蛹的變化，以免與親本相混，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6].

2.8 測(cè)交后代的果蠅的觀察和統(tǒng)計(jì)

待測(cè)交后代果蠅羽化完成時(shí)，麻醉果蠅觀察性狀，麻醉果蠅要把果蠅轉(zhuǎn)移到麻醉瓶中，轉(zhuǎn)移時(shí)先將瓶口對(duì)接，輕敲培養(yǎng)瓶壁，使果蠅進(jìn)入麻醉瓶，然后迅速塞上含有乙醚的瓶塞，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)要觀察果蠅的形狀，所以麻醉果蠅是要進(jìn)行深度麻醉，以免在觀察果蠅時(shí)果蠅蘇醒過(guò)來(lái).觀察測(cè)交后代果蠅性狀為紅眼長(zhǎng)翅果蠅，白眼小翅果蠅，白眼長(zhǎng)翅果蠅和紅眼小翅果蠅四種，其中前兩種為親本型，后兩種為重組型，用顯微鏡及放大鏡觀察果蠅性狀并統(tǒng)計(jì)出四種類(lèi)型的數(shù)量[7].

3 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)如表2所示．

表2 果蠅的類(lèi)型及數(shù)量統(tǒng)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)中親本組合果蠅是白眼小翅果蠅和紅眼長(zhǎng)翅果蠅，共374只+395只=769只；重組合是白眼長(zhǎng)翅果蠅和紅眼小翅果蠅，共140只+107只=247只.所以果蠅的白眼基因與小翅基因的重組頻率=重組合/(重組合+親組合)[8]=247/(247+769)=24%，重組值是24，因此這兩個(gè)基因間的遺傳距離為24cM，如圖1所示.

圖1 白眼基因與小翅基因的遺傳距離

4 討論

4.1 數(shù)據(jù)與分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可以計(jì)算小翅基因和白眼基因間的重組率.我們知道重組是交換的結(jié)果，所以重組率通常也稱(chēng)為交換率，若兩個(gè)基因座位在染色體上分開(kāi)較遠(yuǎn)，那么在雜交時(shí)，這兩個(gè)基因間可能發(fā)生雙交換或四交換等更高數(shù)目的偶數(shù)交換，但形成的配子仍是非重組型的，如圖2所示.這時(shí)如果簡(jiǎn)單的把重組率看作交換率，則交換率要被低估了，而基因是以1%交換率作為圖距單位的，若交換率低估了，圖距自然也隨之縮小了，所以重組率大致代表交換率，但往往小于交換率，綜上所述，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)小于小翅基因和白眼基因之間的實(shí)際距離.

圖2 白眼基因與小翅基因的連鎖與交換

4.2 正交和反交的比較

本實(shí)驗(yàn)中采用白眼小翅果蠅作為母本，野生型作為父本，進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，我們把這種雜交形式看作正交，那么反交即是用白眼小翅果蠅作為父本，野生型作為母本，進(jìn)行雜交.正交與反交可以得到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但反交時(shí)F1代中雌蠅為雜合體，雄蠅為野生型，必須讓F1代雌蠅與隱性親本進(jìn)行雜交才是測(cè)交，這就涉及到處女蠅選擇的問(wèn)題.而正交時(shí)F1代中雌蠅也為雜合體但雄蠅是白眼小翅果蠅，這樣F1代果蠅進(jìn)行自交即為測(cè)交，無(wú)需選擇處女蠅.這種雜交方式既節(jié)省時(shí)間又避免選處女蠅的麻煩同時(shí)也減少因選擇的果蠅不是處女蠅而給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的誤差，綜上所述認(rèn)為本課題采取的正交方式是比較合理的.如圖3、圖4所示.

圖3 正交

圖4 反交

5 前景展望

目前對(duì)于果蠅的研究有很大的進(jìn)展，在各個(gè)領(lǐng)域都有所建樹(shù)，果蠅作為一種很好的模式生物，為科研做出了很大的貢獻(xiàn). 霍華德休斯醫(yī)學(xué)院的研究人員通過(guò)研究果蠅DNA，提出了一個(gè)新證據(jù)，在研究中，研究人員第一次將果蠅的77個(gè)品種組成果蠅族譜，并與他的祖先做比較，用來(lái)確認(rèn)哪些品種的果蠅得到或失去翅膀的斑點(diǎn).這項(xiàng)研究顯示了演化的奧秘.目前，美國(guó)科學(xué)家最新研究顯示，果蠅用RNA干擾機(jī)制抗擊病毒，這是第一次在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象. 此外，英國(guó)科學(xué)家在一項(xiàng)相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，為了應(yīng)對(duì)病毒的迅速變異，果蠅體內(nèi)執(zhí)行RNA干擾任務(wù)的基因也在迅速變化.這些發(fā)現(xiàn)可能為研制新的抗病毒藥物和療法提供線索. 中國(guó)科學(xué)院網(wǎng)2006年2月8日?qǐng)?bào)道 2月2日，國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature以“Article”的形式發(fā)表了題為《果蠅腦對(duì)兩種視覺(jué)參數(shù)的記憶》的研究論文，這一最新發(fā)現(xiàn)表明：果蠅的個(gè)體很小，大腦卻相當(dāng)復(fù)雜，它的視覺(jué)記憶功能需要腦中特定神經(jīng)元形成回路來(lái)完成.Nature同期發(fā)表的評(píng)論文章認(rèn)為這項(xiàng)工作清晰地表明，通過(guò)遺傳學(xué)手段使果蠅成為研究神經(jīng)結(jié)構(gòu)及其功能的較好模型.事實(shí)上，在定位記憶方面可能是最好的模型.這一研究成果首次證明了果蠅中心腦內(nèi)—扇形體結(jié)構(gòu)，參與了視覺(jué)圖形識(shí)別過(guò)程.自然界中，果蠅可以根據(jù)塔門(mén)圖形本身所具有的一些參數(shù)，來(lái)完成一些對(duì)相應(yīng)視覺(jué)圖形的識(shí)別并形成記憶.