胸腺素β10在肺癌細(xì)胞中促進(jìn)VEGF-C表達(dá)機(jī)制研究

李紫璇 曲連悅 鐘紅珊 徐克 邱雪杉

據(jù)《2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示：肺癌居全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率第一位。目前，手術(shù)治療仍是治療肺癌最為行之有效的方法。然而，很多患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。因此，研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)肺癌的防治有重要意義。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，也是判定腫瘤分期，估計(jì)患者預(yù)后的重要因素。因此，近年來(lái)對(duì)于淋巴管特異性標(biāo)記物及其調(diào)控機(jī)理的研究逐漸深入，抗腫瘤淋巴管的形成也成為抗腫瘤治療的新方向。已經(jīng)證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）-C的表達(dá)和淋巴管生成密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)表達(dá)VEGF-C能特異性的誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管的形成[1]。VEGF-C是VEGF家族的成員，它可與VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合，分別調(diào)控血管和淋巴管的生成。

胸腺素是一類(lèi)分子量5 kDa左右的小分子多肽，最初從小牛胸腺中提取，按等電點(diǎn)不同分為三個(gè)家族 （α、β和γ）[2]。其中胸腺素β10（thymosin β10, Tβ10）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最為豐富的β族胸腺素之一，研究[3-5]證實(shí)Tβ10能影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。但目前，Tβ10在腫瘤中的作用存在很大爭(zhēng)議。有研究[4]發(fā)現(xiàn)Tβ10在甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中高表達(dá)，同時(shí)能夠促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，但也有研究[6]證明Tβ10在卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，Tβ10過(guò)表達(dá)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤的凋亡。然而目前Tβ10在不同腫瘤中所發(fā)揮的作用及其機(jī)制仍未有定論。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Tβ10在肺癌中表達(dá)上調(diào)，并與肺癌的分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后有關(guān)[3]。這些結(jié)果初步證實(shí)了Tβ10在肺癌發(fā)生發(fā)展中所起的促進(jìn)作用。在本實(shí)驗(yàn)中我們課題組將在肺癌細(xì)胞系中研究Tβ10對(duì)淋巴管標(biāo)記物VEGF-C的調(diào)控作用，并探討其中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肺癌細(xì)胞系SPC-A-1和A549細(xì)胞購(gòu)自ATCC，LK2購(gòu)自日本癌癥研究中心細(xì)胞資源庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，胎牛血清購(gòu)自碧云天。RNA提取購(gòu)自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及PCR引物合成購(gòu)自TaKaRa。P-AKT（Ser473）（D9E）單克隆抗體購(gòu)自CST；AKT、VEGF-C抗體購(gòu)自Santa Cruz；β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購(gòu)自中杉金橋。BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天，裂解液及超敏發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SPC-A-1、A549和LK2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基含10%的滅活小牛血清。37oC、5%CO2的條件下培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q一次液，并用0.25%的胰酶進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，饑餓4 h后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（文中未給出）加入100 ng/mL Tβ10，按時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)同一個(gè)處理因素設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR提取細(xì)胞總RNA按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)結(jié)束后再取2 μL的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，VEGF-C引物F：5'-TTC CAT TAT TAG ACG TTC CCT G -3'，R：5'-GTG TTT TCA TCA AAT TCT CGG T-3'，片段長(zhǎng)度：305 bp，退火溫度為54oC；β-actin引物F：5'-AAA TCG TGC GTG ACA TTAA-3'，R：5'-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3'，片段長(zhǎng)度：513 bp，退火溫度為55oC。

1.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液冰浴中裂解，低溫高速離心（4oC, 12,000 rpm, 30 min），提取上清為總蛋白。上清蛋白量為60 μg。12%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)?。?0 V, 120 min）到PVDF上。5%BSA室溫封閉2 h。一抗分別用P-AKT（1:1,000）、AKT（1:300）、VEGF-C（1:500）和β-actin（1:500），4 °C孵育過(guò)夜。分別與對(duì)應(yīng)的二抗（1:2,000）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集。進(jìn)行灰度測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組之間用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有意義。

2 結(jié)果

2.1 Tβ10促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SPC-A-1細(xì)胞接種于六孔板中，待其貼壁后在實(shí)驗(yàn)組加入濃度為100 ng/mL的人重組Tβ10，對(duì)照組加入同體積的PBS。分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8h、24 h收集細(xì)胞檢測(cè)各組VEGF-C mRNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入Tβ10后細(xì)胞內(nèi)VEGF-C mRNA含量逐漸上升（圖1）。

2.2 在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10能夠促進(jìn)P-AKT及VEGF-C蛋白表達(dá) 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10后分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h收集細(xì)胞，提取總蛋白后檢測(cè)不同組細(xì)胞P-AKT、AKT及VEGF-C蛋白變化。我們發(fā)現(xiàn)加入濃度為100 ng/mL的Tβ10后P-AKT及VEGF-C蛋白水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高（P＜0.05），但是總的AKT水平未見(jiàn)明顯變化（圖2）。這些結(jié)果說(shuō)明在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10可能是通過(guò)促進(jìn)AKT磷酸化激活促進(jìn)VEGF-C表達(dá)的。

圖1 SPC-A-1細(xì)胞系中加入100 ng/mL人重組Tβ10后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，用RT-PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C mRNA變化，柱圖顯示加入Tβ10后SPC-A-1細(xì)胞中VEGF-C mRNA水平隨時(shí)間推移逐漸上升。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 1 After adding 100 ng/mL human recombinant Tβ10 in SPC-A-1,cells were collected in 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, then RT-PCR was used to detected the mRNA level of VEGF-C. Bar graph display after adding Tβ10, mRNA levels of VEGF-C in SPC-A-1 cells gradually increased over time. *: Compared with the control, P＜0.05; **: Compared with the control, P＜0.01.

圖2 SPC-A-1細(xì)胞系中加入100 ng/mL人重組Tβ10后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C、P-AKT和AKT蛋白變化。如圖所示，VEGF-C和P-AKT蛋白水平逐漸升高，而總AKT水平不變。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 2 After adding 100 ng/mL human recombinant Tβ10 in SPC-A-1,cells were collected in 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, then Western blot was used to detected the protein level of VEGF-C, P-AKT and AKT. As the figure show, the protein level of VEGF-C and P-AKT were increased gradually, but the total AKT level were unchanged. *: Compared with the control, P＜0.05; **: Compared with the control, P＜0.01.

2.3 在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10可能通過(guò)促進(jìn)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C mRNA表達(dá) 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10，8 h后在一組細(xì)胞中加入P-AKT特異性抑制劑LY294002，另一組細(xì)胞不加。加入抑制劑0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后分別提取細(xì)胞的mRNA，檢測(cè)其中VEGF-C水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的進(jìn)展，不加抑制劑組VEGF-C的水平變化很少，而加LY294002組VEGF-C mRNA含量逐漸下降，說(shuō)明LY294002能明顯抑制VEGF-C表達(dá)（P＜0.05）（圖3）。

2.4 在不同細(xì)胞系中Tβ10通過(guò)上調(diào)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C表達(dá) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證Tβ10促進(jìn)VEGF-C表達(dá)的結(jié)論，我們又選擇了兩個(gè)細(xì)胞系：A549及LK2分別加入Tβ10和LY294002，觀察細(xì)胞中VEGF-C蛋白及mRNA變化。在兩種細(xì)胞系中加入Tβ10可以促進(jìn)VEGF-C蛋白及mRNA上調(diào)，如果在加入Tβ10的同時(shí)加入AKT通路特異性抑制劑LY294002則會(huì)使VEGF-C蛋白及mRNA水平下調(diào)（P＜0.01）（圖4，圖5）?？梢?jiàn)，在肺癌細(xì)胞系中Tβ10通過(guò)上調(diào)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C表達(dá)。

3 討論

近年來(lái)，胸腺素類(lèi)家族的小分子化合物在腫瘤中的作用受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了胸腺素的高表達(dá)。Tβ4在腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中表達(dá)增高[7,8]，而且Tβ4的高表達(dá)可能直接增加腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。Tβ10在乳腺癌、黑色素瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、肺癌等中表達(dá)升高[9,10]。Tβ15則在前列腺癌、乳腺癌[11]中高表達(dá)。但也有報(bào)道[5,6]某些胸腺素在腫瘤中低表達(dá)甚至缺失。這些研究表明不同種類(lèi)的胸腺素在不同組織中的作用機(jī)制存在很大差異，這就需要更深入的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證胸腺素類(lèi)的生理作用。

圖3 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10 8 h后一組加入LY294002, 另一組不加， 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后細(xì)胞的VEGF-C mRNA變化比較，發(fā)現(xiàn)LY294002可明顯抑制Tβ10引起的VEGF-C升高。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 3 8 h after adding Tβ10 in SPC-A-1 cells, LY294002 was added in the medium. After 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, mRNA levels of VEGF-C were detected. The results reveals that LY294002 significantly inhibited Tβ10 induced VEGF-C increased. **: Compared with the control, P＜0.01.

圖4 在A549和LK2細(xì)胞中加入Tβ10和LY294002，檢測(cè)細(xì)胞VEGF-C mRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Tβ10能促進(jìn)這兩株細(xì)胞VEGF-C mRNA的表達(dá)，LY294002則能逆轉(zhuǎn)該變化。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 4 In A549 and LK2 cells after adding Tβ10 and LY294002, the mRNA level of VEGF-C was detected. Tβ10 can prompted the expression of VEGF-C, and LY294002 can inhibited the expression of VEGF-C. **: Compared with the control, P＜0.01.

圖5 在A549和LK2細(xì)胞中加入Tβ10和LY294002，檢測(cè)細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Tβ10能促進(jìn)這兩株細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)，LY294002則能逆轉(zhuǎn)這種變化。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 5 In A549 and LK2 cells after adding Tβ10 and LY294002, the protein level of VEGF-C was detected. Tβ10 can prompted the expression of VEGF-C, and LY294002 can inhibited the expression of VEGF-C. **: Compared with the control, P＜0.01.

腫瘤淋巴管生成主要受VEGF-C、-D和VEGFR-3調(diào)控。近年來(lái)多數(shù)研究報(bào)道稱(chēng)：惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是因?yàn)閻盒阅[瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量VEGF-C，并通過(guò)下述3種途徑參與調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：①VEGF-C通過(guò)與VEGFR-3受體結(jié)合，刺激誘導(dǎo)癌旁淋巴管增生，并降低淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，增加了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)[12]；②提高腫瘤細(xì)胞粘附作用。能分泌VEGF-C的腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上受體的親和作用，使腫瘤細(xì)胞得以粘附到淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上；③VEGF-C還可作為一種趨化因子，使腫瘤細(xì)胞向淋巴管方向遷移。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，Tβ10在肺癌中表達(dá)上調(diào)并與肺癌淋巴管密度及VEGF-C表達(dá)密切相關(guān)，這促使我們進(jìn)一步研究Tβ10在肺癌中通過(guò)上調(diào)VEGF-C表達(dá)促進(jìn)淋巴管形成的機(jī)制。AKT和腫瘤血管及淋巴管生成密切相關(guān)，Tsutsui等[13]證明在乳腺癌中AKT可以通過(guò)VEGF-C促進(jìn)淋巴管形成。而另有文獻(xiàn)[7]報(bào)道與Tβ10同家族的Tβ4可以在內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)AKT磷酸化從而發(fā)揮Tβ4促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能。因此我們推測(cè)Tβ10在肺癌細(xì)胞中可能通過(guò)促進(jìn)AKT磷酸化促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)。

由于胸腺素是小分子多肽，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可以采用外源加入人重組蛋白的方法檢測(cè)胸腺素類(lèi)的生理作用[7,14]，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們采用的是加入外源Tβ10的實(shí)驗(yàn)方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SPC-A-1細(xì)胞中加入100 ng/mL人重組Tβ10可以促進(jìn)VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Tβ10是否是通過(guò)促進(jìn)AKT磷酸化促進(jìn)VEGF-C表達(dá)，我們又同時(shí)檢測(cè)了加入Tβ10后P-AKT的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)加入Tβ10后在VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)的同時(shí)P-AKT表達(dá)也升高，而總的AKT的水平不發(fā)生變化。如果在加入Tβ10同時(shí)又加入了P-AKT抑制劑則能明顯抑制VEGF-C表達(dá)。為了能證明我們推測(cè)的結(jié)論，我們又在另外兩株肺癌細(xì)胞系中重復(fù)了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞系中Tβ10均能通過(guò)P-AKT通路促進(jìn)VEGF-C表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明在肺癌中Tβ10促進(jìn)淋巴管生成的功能是通過(guò)促進(jìn)AKT磷酸化進(jìn)而促進(jìn)VEGF-C表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，Tβ10在肺癌中促進(jìn)淋巴管形成的作用是通過(guò)激活A(yù)KT通路促進(jìn)VEGF-C表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。Tβ10在肺癌中作為一個(gè)癌基因，對(duì)它的深入研究對(duì)闡明肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尤其是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制有著重要的意義。