共培養(yǎng)體系中高紅色熒光蛋白（RFP）標記結(jié)腸癌細胞的檢測技術(shù)

陳孫霞 王曉慶 徐曉恩 姜英華 劉 鋒△

（1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系 上海 200433）

共培養(yǎng)體系中高紅色熒光蛋白（RFP）標記結(jié)腸癌細胞的檢測技術(shù)

陳孫霞1，2王曉慶1，2徐曉恩1姜英華1劉 鋒1△

（1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系 上海 200433）

目的提高mCherry紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）在結(jié)腸癌細胞中的表達，從而可以通過檢測共培養(yǎng)體系中細胞的熒光值來分析結(jié)腸癌細胞的增殖，以利于結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境的研究。方法用293FT細胞制備pBMN-mCherry病毒液。利用多次感染（1～4次）的方法提高RFP在結(jié)腸癌細胞系HT29、Lo Vo、SW620及HCT116中的表達，經(jīng)流式細胞儀檢測得到不同感染次數(shù)細胞RFP標記的陽性率，并將高陽性表達RFP的結(jié)腸癌細胞HT29的熒光值與細胞數(shù)量關(guān)系進行比較，分析評價兩者的線性關(guān)系。結(jié)果通過優(yōu)化，熒光標記效率大幅度提高。結(jié)腸癌腫瘤成纖維細胞共培養(yǎng)中，熒光值與細胞數(shù)量線性關(guān)系R2＞0.9；該方法成功用于檢測共培養(yǎng)體系中單種細胞增殖。結(jié)論在結(jié)腸癌細胞和成纖維細胞的共培養(yǎng)體系中，結(jié)腸癌細胞的增殖可以通過檢測細胞熒光值來分析。

紅色熒光蛋白（RFP）；共培養(yǎng)；細胞增殖；結(jié)腸癌

*This work was supported by the Chinese National Key Program on Basic Research（973）（2011CB910702，2013CB911201）.

腫瘤的生長不僅與惡性腫瘤細胞有關(guān)，也與腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞相關(guān)。在實體腫瘤組織中，除了腫瘤細胞本身外，腫瘤微環(huán)境中還包含成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞、炎性細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及胞外基質(zhì)等［1-2］。而成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細胞。血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα）［3］及波形蛋白（vimentin，VIM）是成纖維細胞的標志物［4］，而平滑肌肌動蛋白α（alphasmooth muscle actin，α-SMA）則是成纖維細胞活化的標志［5］。結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來在引起死亡的腫瘤中位居第三［6］。對結(jié)腸癌微環(huán)境的研究逐漸成為熱點。

將基質(zhì)細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)，是研究腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的重要手段［7］。近年來，細胞共培養(yǎng)技術(shù)日趨多樣化。體外共培養(yǎng)技術(shù)包括接觸或者非接觸。接觸培養(yǎng)包括二維（two dimentional，2D）培養(yǎng)或者模擬腫瘤體內(nèi)微環(huán)境的三維（three dimentional，3D）培養(yǎng)技術(shù)。其中2D培養(yǎng)技術(shù)是將一種細胞接種在另一種細胞之上或者將兩種細胞混合后接種。這種培養(yǎng)方法可以檢測細胞的增殖、細胞的形態(tài)學(xué)變化以及細胞遷移等。該類方法操作簡單，對于研究早期的腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細胞相互作用具有很大意義。例如Li等［8］將骨髓基質(zhì)細胞與臍靜脈內(nèi)皮細胞進行2D共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)u-PA和MMP2促進自組裝網(wǎng)絡(luò)的形成，與內(nèi)皮細胞的遷移有關(guān)。Xu等［9］用微流控芯片3D共培養(yǎng)技術(shù)對肺癌細胞藥物敏感性進行了研究。

腫瘤細胞的增殖是檢測腫瘤微環(huán)境的重要指標之一［10］。在本研究中，我們優(yōu)化了成纖維細胞與結(jié)腸癌細胞共培養(yǎng)體系中細胞增殖情況的檢測方法。我們選擇性地用紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）標記結(jié)腸癌細胞［11］，以利用熒光吸收值檢測細胞增殖情況［12］；利用多次標記技術(shù)大幅度提高熒光標記效率，同時采用整體熒光檢測的方法來檢測細胞增殖。優(yōu)化后的方法縮短了檢測時間、提高了檢測通量，使檢測更加簡易可行，減少了原代成纖維細胞的消耗及研究成本。這種方法的應(yīng)用也使得早期的腫瘤體外研究體系更簡單。

材料和方法

主要實驗儀器多功能酶標儀Synergy H4（美國伯騰儀器有限公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；熒光倒置顯微鏡DP70（日本奧林巴斯有限公司）。

材料和試劑結(jié)腸癌細胞系SW620、Lo Vo和HCT116（中科院上海生命科學(xué)研究院細胞庫），HT29細胞系（復(fù)旦大學(xué)上海市公共衛(wèi)生臨床中心張麗軍博士惠贈）；感受態(tài)DH5α（北京天根生化科技有限公司）；96 well Assay Plate Black Plate（普通96孔板）和96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates（Corning，3340，以下簡稱96孔黑板）。其他試劑包括：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Opti-MEM和McCoy′s 5A Medium（美國Gibco公司）；RPMI 1640、DMEM/F12、DMEM/F12（無酚紅）、DMEM（High glucose）和Fetal bovine serum（FBS）（美國HyClone公司）；中抽試劑盒NucleoBond Xtra Midi（德國MACHERY-NAGEL公司）；4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Alexa Fluor-488-labeled兔抗IgG（美國Invitrogen公司）。

細胞培養(yǎng)Lo Vo細胞用RPMI 1640/10％FBS培養(yǎng)，SW620用DMEM/10％FBS培養(yǎng)，HT29、HCT116細胞用McCoy′s 5A培養(yǎng)基（美國Gibco公司）/10％FBS培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)基中加入1％青霉素/鏈霉素（美國Hyclone公司），細胞放置在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

質(zhì)粒pBMN-mCherry及pCL10A的擴增p BMN-mCherry，質(zhì)粒及逆轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒p CL10A（由本實驗室保存）；取1～5ng p BMN-mCherry及p CL10A質(zhì)粒DNA分別加入到50μL的感受態(tài)DH5a中，混勻后置于冰上30min，42℃熱激后加入LB培養(yǎng)基，于37℃搖床內(nèi)孵育。待細菌增殖至菌液D600為0.5～0.8時，按照NucleoBond Xtra Midi說明書提取質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA質(zhì)量D260/280為1.7～1.9。

p BMN-mCherry病毒液制作及感染將生長良好的293FT細胞（1×106）傳代到10cm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前24h換成無雙抗的培養(yǎng)基。將pBMN-mCherry和pCL10A兩種質(zhì)粒各10μg混合到500μL OPTI-MEM中。將8μL Lipofectamine 2000加到500μL OPTI-MEM中，然后將兩種溶液混合均勻后靜置20min，加入到293FT細胞中。48h后，收取病毒上清，1 000×g離心10min后用0.45μm濾膜過濾。將病毒上清滴加到HT29、SW620、Lo Vo和HCT116細胞中。為提高標記效率，我們采取多次感染的方法，每24h更換感染病毒液，重復(fù)感染1～3次，并用Olympus IX51熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀檢查、評估標記效率。

Western blot檢測待指數(shù)生長期的細胞生長至90％融合度時，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入SDS裂解液，提取蛋白，根據(jù)BCA法定量蛋白濃度；配置10％分離膠及5％濃縮膠后對蛋白進行上樣；接著進行電泳及轉(zhuǎn)膜，最后進行抗體免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光。

CCK-8法檢測細胞增殖將1 500個生長良好的細胞接種于96孔培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2孵箱中孵育；每天取出1個96孔板加10％CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育1.5h后，在450nm處測定吸光度（D）值，根據(jù)D值繪制細胞生長曲線，隔天檢測3天。

原代成纖維細胞的分離、消化和培養(yǎng)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準，收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院結(jié)腸癌手術(shù)切除的新鮮癌旁組織（與腫瘤組織間隔＞5cm）和腫瘤組織于無菌D-hanks溶液中保存。在超凈工作臺中，將新鮮組織用75％乙醇漂洗兩次，在無菌D-hanks液中漂洗2次，用鑷子仔細去除壞死組織和血塊。用眼科手術(shù)剪將組織盡可能剪成小塊，視組織大小加3倍體積膠原酶溶液（200μ/mL，Sigma）37℃水浴消化，待消化溶液變黏稠，加胰酶于37℃繼續(xù)消化3～5min。將細胞懸液過100μm的細胞篩網(wǎng)（BD Falcon）后收集，800×g離心5min。沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌1遍，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，待細胞密度80％～90％時傳代。

細胞免疫熒光將生長狀態(tài)的成纖細胞種植在48孔板內(nèi)的細胞免疫熒光爬片上，置于7℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后去除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗3次后先對細胞進行固定，PBS洗3次后再用通透液孵育30min。PBS洗去通透液，用5％BSA對細胞進行封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h。細胞核染色用4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色1min，最后用熒光倒置顯微鏡對細胞進行熒光拍照。

成纖維細胞與結(jié)腸癌細胞共培養(yǎng)本實驗采取細胞混合培養(yǎng)方法，檢測結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細胞與結(jié)腸癌細胞的共培養(yǎng)對腫瘤細胞增殖的影響。將單層培養(yǎng)的成纖維細胞和熒光標記后的結(jié)腸癌細胞分別消化，按比例直接混合后接種于細胞培養(yǎng)皿中（96孔黑板），單獨培養(yǎng)的熒光標記腫瘤細胞作為對照。

共培養(yǎng)熒光細胞的計數(shù)檢測將轉(zhuǎn)染1～4次病毒液的細胞按相同的體積及條件消化后，加入1mL PBS，取2mL過細胞篩網(wǎng)后，用流式細胞儀檢測其陽性標記率。對照為未標記細胞。

共培養(yǎng)細胞熒光信號的整體檢測將不同數(shù)量的細胞種植在普通96孔板或96孔黑板中，用多功能酶標儀Synergy H4檢測不同細胞數(shù)對應(yīng)的熒光值。在共培養(yǎng)體系中，將成纖維細胞與腫瘤細胞混合培養(yǎng)于96孔黑板中，分別檢測熒光值。檢測時根據(jù)文獻報道及實驗調(diào)整，激發(fā)光為587nm，發(fā)射光為610nm，狹長設(shè)置為10nm；溫度為37℃，掃描采用Area scan法或者Top read法。

統(tǒng)計學(xué)方法對照組成纖維細胞的生長與實驗組成纖維與腫瘤細胞共培養(yǎng)后的細胞生長差異采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用t檢驗，差異顯著性檢驗水平設(shè)為雙尾0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

p BMN-mCherry病毒液感染標記結(jié)腸癌細胞用pBMN-mCherry病毒液，分別感染結(jié)腸癌細胞系HT29、SW620、Lo Vo及HCT116以進行熒光蛋白標記。在p BMN-mCherry首次標記后，熒光信號比較低，顯微鏡視野中大多數(shù)為未標記的細胞（圖1A）。如果進行再次標記，RFP標記效率有所提高（圖1B）。而在感染第4次時，結(jié)腸癌細胞的標記效率大幅提高，顯微鏡視野下幾乎大部分的細胞均為RFP標記細胞（圖1C）。這些結(jié)果提示，多次標記可以提高pBMN-mCherry病毒液的感染效率。

圖1 重復(fù)感染pBMN-mCherry病毒提高結(jié)腸癌細胞的標記效率（×200）Fig 1 Repeated infection with pBMN-mCherry virus increases labeling efficiency of colon cancer cell lines（×200）

熒光標記效率的檢測我們用流式細胞儀檢測不同標記次數(shù)的結(jié)腸癌細胞陽性標記率，同時檢測標記效率是否能夠隨著感染次數(shù)增多而持續(xù)增高。檢測結(jié)果表明，隨著pBMN-mCherry病毒液感染次數(shù)增加，細胞的RFP標記率明顯提高，在HCT116和HT29細胞中甚至接近100％（圖2）。圖2下為細胞用p BMN-mCherry病毒液感染5次后的陽性標記率，我們發(fā)現(xiàn)第5次感染對于進一步提高細胞的標記效率幾乎沒有效果。這些結(jié)果表明，p BMN-mCherry病毒液感染以上4種結(jié)腸癌細胞，經(jīng)過4次標記即可達到較高的RFP標記率［13］。我們對高標記的細胞多次傳代，間隔2個月后對高標記率的HT29細胞進行檢測，結(jié)果顯示細胞的陽性標記率幾乎沒有改變（圖2B）。生長曲線分析表明多次標記對細胞生長沒有顯著影響（圖2C）。細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化（圖2D）。

熒光信號與細胞增殖的關(guān)系檢測共培養(yǎng)體系中的單種細胞通常使用流式細胞儀，但耗時長，對細胞需求量大，對細胞標記率要求高。

在本研究中，為監(jiān)測共培養(yǎng)體系中結(jié)腸癌細胞的增殖狀態(tài)，我們檢測共培養(yǎng)體系中的整體熒光值，對不同給定數(shù)量的熒光細胞的熒光值做標準曲線。我們采用兩種96孔板進行細胞培養(yǎng)和檢測。結(jié)果表明普通96孔板熒光值與細胞數(shù)量之間未呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系，而96孔黑板的熒光檢測值與細胞數(shù)量呈線性關(guān)系，結(jié)果較穩(wěn)定（圖3A）。對于酶標儀的讀取方法，選用面積掃描0.99（圖3C）讀取的熒光值與細胞量的線性關(guān)系優(yōu)于點讀取0.98（圖3D）。圖3B中，對于低標記的細胞（m1HT29代表HT29細胞經(jīng)過一次標記）其細胞的熒光數(shù)值增長十分緩慢，不能客觀地代表細胞增殖曲線。而高標記的細胞（m4 HT29代表HT29細胞經(jīng)過4次標記）中，細胞的增殖數(shù)值偏向正常值（圖3）。

采用上述綜合方法，可以得到熒光值與細胞的線性關(guān)系為0.9924，并且將m4 HT29與結(jié)腸癌正常成纖維細胞混合共培養(yǎng)后，其線性關(guān)系也可達到0.99（圖3D、E）。以上結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)體系中，可以用細胞整體熒光值檢測單種細胞的增殖量。

原代結(jié)腸癌成纖維細胞的鑒定我們從新鮮結(jié)腸癌組織及癌旁組織中分離出一對成纖維細胞，正常結(jié)腸成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs）來自于癌旁正常組織，結(jié)腸癌腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）來自于結(jié)腸癌腫瘤組織。免疫熒光實驗顯示NFs及CAFs的a-SMA及Vimentin（VIM）染色結(jié)果為完全陽性（圖4A），而上皮細胞標志物E-cadherin免疫熒光顯示為完全陰性（數(shù)據(jù)未展示）。Western blot實驗檢測成纖維細胞標志物a-SMA，Vimentin及PDGFRa在成纖維細胞均有表達（圖4B）。

圖2 紅色熒光蛋白陽性率及高標記熒光細胞的生物學(xué)特征Fig 2 Detection of RFP labeling rate by flow cytometer and the biological characteristics of high labeling cells

結(jié)腸癌成纖維細胞對HT29細胞增殖的影響將成纖維細胞與結(jié)腸癌細胞1∶1混合后共培養(yǎng)，第7天的檢測結(jié)果表明，正常成纖維細胞（CC-0426NF，P=0.014）及腫瘤成纖維細胞（CC-0426TAF，P=0.007）顯著抑制共培養(yǎng)中結(jié)腸癌細胞HT29的增殖（圖5）。在1∶2的比例混合共培養(yǎng)中，正常成纖維細胞CC-0426NF對HT29細胞的增殖起到了顯著的抑制作用（P＜0.01，n=5）。所以我們可以初步判斷體外共培養(yǎng)體系中，正常結(jié)腸癌成纖維細胞對HT29細胞的增殖起到了抑制作用，而腫瘤相關(guān)成纖維細胞對HT29的作用則有待于我們進一步研究。

圖3 熒光值與細胞數(shù)量的關(guān)系Fig 3 The relationship between cell count and fluorescence value

圖4 原代結(jié)腸癌成纖維細胞標志物的檢測Fig 4 The expression of common fibroblast protein markers in the primary fibroblasts

圖5 結(jié)腸癌成纖維細胞對HT29細胞增殖的影響Fig 5 The influence of colon fibroblasts on HT29 cells

討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用及影響，近年來逐漸成為人們研究的熱點。由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，腫瘤微環(huán)境一直是研究的難點和熱點。過去的十多年中已經(jīng)認同了腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生及發(fā)展有著顯著的影響，腫瘤與微環(huán)境之間的“Crosstalk”很大程度上影響著腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力［14-15］。腫瘤細胞的增殖是檢測腫瘤微環(huán)境的重要指標之一［15］。我們將腫瘤細胞進行熒光蛋白標記，通過檢測共培養(yǎng)中的熒光信號，分析腫瘤細胞的增殖情況。提高檢測效率的關(guān)鍵是提高標記效率。本實驗利用多次感染的方法來提高pBMN-mCherry對結(jié)腸癌細胞的標記效率，且這種標記效率能保持至少一個月以上的穩(wěn)定期，該檢測結(jié)果與已有文獻報道一致［13］，且在生物學(xué)特性上沒有明顯改變。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4次感染，RFP標記效率達到最高值，HCT116及HT29細胞的標記率均從首次標記的31％和36％分別提高到96％和99％，SW620及Lo Vo細胞則達到60％～70％。高效標記省去流式細胞儀篩選富集的步驟，提高了熒光檢測效率。

共培養(yǎng)方法包括傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)方法及近幾年的熱點3D培養(yǎng)［16］。但是由于3D培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜并且價錢相對昂貴，對于腫瘤微環(huán)境共培養(yǎng)體系的初步研究中我們?nèi)匀贿x擇2D法進行研究。2D共培養(yǎng)包括非接觸及接觸式培養(yǎng)。前者利用Transwell平板共培養(yǎng)，一般采用錐蟲藍計數(shù)法檢測細胞增殖［17］。后者檢測細胞增殖一般采用流式細胞儀法統(tǒng)計細胞數(shù)量［18］，但其價格高、操作繁瑣，不便于通量檢測。本實驗采用高標記的細胞監(jiān)測共培養(yǎng)體系中單種細胞的增殖。首先，需要對細胞的熒光值與細胞數(shù)量的線性關(guān)系進行研究［19］，我們利用Synergy H4對HT29不同的細胞量（0～4×104），進行了熒光值檢測。高標記的熒光值不僅與細胞數(shù)量呈線性關(guān)系（＞0.99），數(shù)值的絕對值也與真實的細胞數(shù)量增速接近，而低熒光標記的細胞兩項表現(xiàn)都較差。所以，細胞的熒光標記率達到一定的值，熒光值可以很好地代表細胞的增殖速度，熒光標記率越高越好。其次，我們需要驗證共培養(yǎng)體系中這種熒光值代表單種細胞增殖的關(guān)系是否仍然存在。因此我們選擇了正常的結(jié)腸癌細胞與m4 HT29細胞進行直接接觸的混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示RFP在610nm的讀數(shù)與共培養(yǎng)中細胞的數(shù)量呈線性關(guān)系（R=0.9974）。提示該方法可以用于早期2D共培養(yǎng)體系中單種細胞增殖的檢測，簡便了共培養(yǎng)體系的檢測方法。

高熒光標記的細胞不僅可應(yīng)用于共培養(yǎng)體系細胞增殖檢測，也可用于該體系中的細胞形態(tài)觀察［20-21］，例如在3D培養(yǎng)體系中可以實時監(jiān)測標記細胞的形態(tài)變化［22］，還可用于小鼠體內(nèi)實驗的研究等［23］。

最后，我們運用該方法將m4 HT29與一對結(jié)腸癌成纖維細胞0426NF/TAF進行了共培養(yǎng)。并用上述方法檢測共培養(yǎng)體系與單培養(yǎng)體系中HT29細胞的增殖量。通過實驗，我們看到在HT29與0426NF 1∶1或1∶2時，正常成纖維細胞顯著抑制腫瘤細胞的生長，而在與0426TAF的共培養(yǎng)中由于成纖維細胞與HT29的比例不同，則出現(xiàn)了不同的結(jié)果，該結(jié)果與Sadlonova等［24］的報道一致。關(guān)于這項研究還有待深入探討。

綜上所述，高RFP標記的細胞可以應(yīng)用于接觸式的2D共培養(yǎng)體系中單種細胞增殖情況的檢測。這一方法的應(yīng)用，簡化了對早期共培養(yǎng)體系中腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)細胞相互作用的研究，也為我們后續(xù)的研究提供了基礎(chǔ)及方向。

［1］Ostman A，Augsten M.Cancer-associated fibroblasts and tumor growth-bystanders turning into key players［J］.Curr Optn Genet Dev，2009，19（1）：67-73.

［2］Pietras K，Ostman A.Hallmarks of cancer：interactions with the tumor stroma［J］.Exp Cell Res，2010，316（8）：1324-1331.

［3］Gerber DE，Gupta P，Dellinger MT，et al.Stromal platelet-derived growth factor receptor alpha（PDGFRalpha）provides a therapeutic target independent of tumor cell PDGFRalpha expression in lung cancer xenografts［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（11）：2473-2482.

［4］Franco OE，Shaw AK，Strand DW，et al.Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis［J］.Semtn Cell Dev Btol，2010，21（1）：33-39.

［5］Lazard D，Sastre X，F(xiàn)rid M G，et al.Expression of smooth muscle-specific proteins in myoepithelium and stromal myofibroblasts of normal and malignant human breast tissue［J］.Proc Natl Acad Sct U S A，1993，90（3）：999-1003.

［6］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Cltn，2013，63（1）：11-30.

［7］van Moorst M，Dass C R.Methods for co-culturing tumour and endothelial cells：systems and their applications［J］.J Pharm Pharmacol，2011，63（12）：1513-1521.

［8］Li H，Daculsi R，Bareille R，et al.uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells［J］.J Cell Btochem，2013，114（3）：650-657.

［9］Xu Z，Gao Y，Hao Y，et al.Application of a microfluidic chip-based 3D co-culture to test drug sensitivity for individualized treatment of lung cancer［J］.Btomatertals，2013，34（16）：4109-4117.

［10］Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z.Matrix metalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment［J］.Cell，2010，141（1）：52-67.

［11］Zhuang Q，Qing X，Ying Y，et al.Class IIa histone deacetylases and myocyte enhancer factor 2 proteins regulate the mesenchymal-to-epithelial transition of somatic cell reprogramming［J］.J Btol Chem，2013，288（17）：12022-12031.

［12］Straussman R，Morikawa T，Shee K，et al.Tumour microenvironment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion［J］.Nature，2012，487（7408）：500-504.

［13］Chen X，Aledia AS，Ghajar CM，et al.Prevascularization of a fibrin-based tissue construct accelerates the formation of functional anastomosis with host vasculature［J］.Ttssue Eng Part A，2009，15（6）：1363-1371.

［14］Mbeunkui F，Johann DJ.Cancer and the tumor microenvironment：a review of an essential relationship［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（4）：571-582.

［15］Liotta LA，Kohn EC.The microenvironment of the tumour-host interface［J］.Nature，2001，411（6835）：375-379.

［16］van Ewijk W，Wang B，Hollander G，et al.Thymic microenvironments，3-D versus 2-D？［J］.Semtn Immunol，1999，11（1）：57-64.

［17］Ma J，Shen Z，Zhang Q，et al.The effect of siRNA-VEGF on the growth of RECin retinal pigment epithelial cell and retinal endothelial cell co-culture system［J］.Eye Sct，2011，26（2）：75-79.

［18］Zhu W，Xu W，Jiang R，et al.Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo［J］.Exp Mol Pathol，2006，80（3）：267-274.

［19］Bootman MD，Rietdorf K，Collins T，et al.Converting fluorescence data into Ca2+concentration［J］.Cold Sprtng Harb Protoc，2013，2013（2）：126-129.

［20］Parkinson K，Baines A E，Keller T，et al.Calciumdependent regulation of Rab activation and vesicle fusion by an intracellular P2X ion channel［J］.Nat Cell Btol，2014，16（1）：87-98.

［21］Shang Y，Tamai M，Ishii R，et al.Hybrid sponge comprised of galactosylated chitosan and hyaluronic acid mediates the co-culture of hepatocytes and endothelial cells［J］.J Btosct Btoeng，2014，117（1）：99-106.

［22］Blumenthal J，Cohen-Matsliah S I，Levenberg S.Olfactory bulb-derived cells seeded on 3D scaffolds exhibit neurotrophic factor expression and pro-angiogenic properties［J］.Ttssue Eng Part A，2013，19（19-20）：2284-2291.

［23］Volk-Draper L D，Rajput S，Hall K L，et al.Novel model for basaloid triple-negative breast cancer：behavior in vivo and response to therapy［J］.Neoplasta，2012，14（10）：926-942.

［24］Sadlonova A，Novak Z，Johnson MR，et al.Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in threedimensional in vitro co-culture［J］.Breast Cancer Res，2005，7（1）：R46-R59.

The technology of detecting high red fluorescence protein（RFP）labeled colon cancer cells in a co-culture system

CHEN Sun-xia1，2，WANG Xiao-qing1，2，XU Xiao-en1，JIANG Ying-hua1，LIU Feng1△
（1Instttute of Btomedtcal Sctences，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200032，Chtna；2Department of Chemtstry，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200433，Chtna）

ObjectiveTo improve the expression efficiency of the mCherry red fluorescence protein（RFP）in colorectal cancer cells.So that the proliferation of colon cancer cells in the co-culture system can be easily monitored by measuring the fluorescence signals，which is suitable for colorectal cancer microenvironment analysis.Methods293FT cells were used to produce the pBMN-mCherry virus，which was used to infect the colon cancer cell lines HT29，Lo Vo，SW620 and HCT116.The labeling procedure was repeated up to four times to improve the labeling efficiency of the RFP.The positively labeled cells of each round labeling were detected by flow cytometer.The fluorescence value of HT29 with highly labeled RFP was compared with its cell count and the linear relationship between both values was evaluated.ResultsAfter optimization，the fluorescence labeling efficiency was greatly improved.A linear coefficient correlation of R2＞0.9 was achieved between the florescence value andthe cell count when analyzing the proliferation of colon cancer cells in the co-cultured system.ConclusionsIn a co-culture system of colon cancer cells and fibroblasts，the proliferation of colon cancer cells can be measured by detecting their fluorescence signals.

red fluorescence protein（RFP）；co-culture；cell proliferation；colorectal cancer

R 735.3+5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.006

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB910702，2013CB911201）

△Corresponding author E-mail：liuf@fudan.edu.cn

2014-01-17；編輯：王蔚）