威寧黃牛CIS基因啟動子區(qū)SNP及其與生長性狀相關(guān)研究

蔣會梅，張義玲，張貴祥，袁 軍，楊永強(qiáng)，劉若余*

(1.貴州畢節(jié)地區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025)

科學(xué)研究

威寧黃牛CIS基因啟動子區(qū)SNP及其與生長性狀相關(guān)研究

蔣會梅1，張義玲1，張貴祥1，袁 軍1，楊永強(qiáng)2，劉若余2*

(1.貴州畢節(jié)地區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025)

為研究CIS基因啟動子區(qū)SNP與黃牛生長相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)性，選擇106頭威寧黃牛作為研究對象，利用PCR-SSCP分析CIS基因啟動子區(qū)SNP與不同個(gè)體生長相關(guān)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明：A-726G位點(diǎn)在威寧黃牛中有不同分型，母畜群體中，該SNP位點(diǎn)與體直長、胸圍、胸寬、腰高、坐骨端寬有顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，其中對胸寬的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，AA型個(gè)體多項(xiàng)性狀均值均最高；在公畜群體中，A-726G位點(diǎn)與胸寬有顯著關(guān)聯(lián)，A-726G可能作為影響黃牛生長性狀的重要功能性SNP，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明CIS基因功能奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

CIS；SNP；啟動子；威寧黃牛

細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制子(SOCS)家族對生長激素(GH)在內(nèi)的細(xì)胞因子或生長因子信號通路起負(fù)調(diào)控作用[1-3]。包括CIS和SOCS1-7共8個(gè)成員，CIS蛋白包含C端的SH2結(jié)構(gòu)域、SOCS box和N端結(jié)構(gòu)域。CIS蛋白可抑制GH誘導(dǎo)的JAK2、GHR、STAT5a和STAT5b磷酸化作用而減弱GH信號級聯(lián)反應(yīng)[4]，但首先需要引起GHR胞質(zhì)內(nèi)在化(internalization)[5]，而高濃度GH導(dǎo)致CIS基因表達(dá)水平瞬時(shí)上升[6]。CIS蛋白還可通過直接與GHR酪氨酸磷酸化殘基結(jié)合抑制GH信號途徑[7]?；騿幼幼儺愑绊懟虮磉_(dá)水平。目前對于牛CIS基因啟動子多態(tài)性研究極少，楊永強(qiáng)等[8]在貴州務(wù)川黑牛、貴州荷斯坦奶牛CIS基因啟動子區(qū)篩查到3個(gè)SNP位點(diǎn)。貴州地方黃牛品種存在生長速度慢，體型較小等問題，提高貴州黃牛生長性能是今后貴州黃牛品種選育的主要任務(wù)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究CIS基因啟動子區(qū)SNP功能，選擇貴州地方優(yōu)良黃牛品種威寧黃牛為研究對象，針對上述3個(gè)SNP位點(diǎn)研究其與威寧黃牛生長相關(guān)性狀間關(guān)聯(lián)性，為篩選影響黃牛生產(chǎn)性能的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

106頭威寧黃牛血樣采自貴州省威寧縣，均為成年牛，其中公畜51只，母畜55只，按相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)測定個(gè)體體高、體斜長、體直長、胸圍、管圍、胸深、胸寬、腰高和坐骨端寬共9個(gè)生長相關(guān)性狀指標(biāo)。利用生工生物公司的血液基因組提取試劑盒提取牛DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，每個(gè)DNA樣品濃度使用紫外分光光度計(jì)測量3次，取平均值。

1.2 引物設(shè)計(jì)和DNA擴(kuò)增

根據(jù)牛CIS基因(GenBank登錄號：AC_000179.1)DNA序列，利用Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)2對特異性引物，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系為15 μL：上、下游引物(濃度為10 pmol/μL)各0.75 μL，2×Taq PCR Master Mix試劑7.5 μL，模板DNA 1 μL，三蒸水5 μL。采用Bio-Rad公司PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，最佳溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

表1 引物序列、退火溫度及目的片段長度Table 1 Sequences of primer,annealing temperature and predicted length of amplified DNA

1.3 基因分型和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

擴(kuò)增出特異性PCR產(chǎn)物后，利用PCR-SSCP方法對所有個(gè)體進(jìn)行基因型檢測，SSCP條件為：PCR產(chǎn)物與變性劑按1∶1比例混合，100 ℃水浴變性10 min，迅速放置于-20 ℃冰箱15 min，利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳在200V電壓下運(yùn)行8 h，銀染法進(jìn)行染色、顯色。挑選不同基因型個(gè)體進(jìn)行DNA測序確定不同基因型。EXCEL軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率等，考慮性別因素，利用SPSS軟件建立一般線性模型，進(jìn)行SNP與生長性狀間關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

針對3個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)2對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別為292 bp和379 bp，從圖1可看出,擴(kuò)增條帶單一、明亮，擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)序列，說明引物特異性好，可用于后續(xù)SSCP分型研究。

圖1 威寧黃牛CIS基因不同引物DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of DNA amplification of CIS in Weining Cattle

2.2 基因分型及測序驗(yàn)證

利用106個(gè)威寧黃牛個(gè)體進(jìn)行PCR-SSCP研究，結(jié)果見圖2。由圖2知，CIS-1引物擴(kuò)增產(chǎn)物具有三種基因型，分別命名為GG、GA、AA，而CIS-2引物擴(kuò)增產(chǎn)物未發(fā)現(xiàn)不同基因型，可能威寧黃牛個(gè)體中-85 bp位點(diǎn)不具有多態(tài)性特征。挑選不同基因型個(gè)體進(jìn)行DNA測序，利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，測序峰圖見圖3。

圖2 CIS基因啟動子區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP檢測結(jié)果A.CIS-1引物SSCP檢測；B.CIS-2引物SSCP檢測Fig.2 SSCP results of PCR production in CIS promoter regionA.represented CIS-1;B.represented CIS-2

由表2可知，A-726G位點(diǎn)在公畜、母畜群體中G等位基因均為優(yōu)勢基因，頻率分別為0.5295、0.6000，公畜中GG、AG基因型頻率接近，AA基因型頻率最低，而母畜中AA、AG基因型頻率接近，AA基因型頻率同樣為最低，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明威寧黃牛A-726G位點(diǎn)的基因型頻率沒有受到選擇、突變或遷移等因素影響。隨后建立一般線性模型進(jìn)行SNP位點(diǎn)與9個(gè)體尺性狀間關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果見表3。在母畜中，A-726G位點(diǎn)對體直長、胸圍、胸寬、腰高、坐骨端寬的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，對胸寬達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，AA型個(gè)體具有更出色的體直長、胸圍、胸寬、腰高、坐骨端寬性狀，而在公畜中，A-726G位點(diǎn)僅對胸寬的影響達(dá)到顯著水平，AA型個(gè)體胸寬均值最高，而SNP對其他性狀無顯著性關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明A-726G對威寧黃牛體尺性狀有重要影響。

圖3 CIS基因G-726A位點(diǎn)不同基因型個(gè)體測序結(jié)果Fig.3 Sequencing of various genotypes in G-726A of CIS gene

表2 A-726G在威寧黃牛群體中等位基因和基因型頻率Table 2 Allele and genotype frequencies at A-726G locus in Weining Cattle

注：括號中數(shù)字為個(gè)體數(shù)。

Notes:data in brackets are individual numbers.

表3 CIS基因中A-726G與威寧黃牛體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析Table 3 Association analysis of A-726G SNP genotypes with body measurement traits at Weining Cattle CIS gene

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.01)，肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes:In the same wlumn,datm with different superscripts lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),with different superseripts uppercase letters irdicate highly sighificant different(P<0.01).

3 討 論

CIS基因能被GH等多種細(xì)胞因子或生長因子激活[9-10]。GH首先誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體GHR二聚體化，進(jìn)而激活STAT蛋白形成二聚體進(jìn)入核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)下游基因表達(dá)[11]，CIS蛋白通過抑制STAT蛋白與下游蛋白的結(jié)合而減弱GH信號通路。CIS蛋白一條途徑通過與STAT5B競爭GHR酪氨酸磷酸化位點(diǎn)而部分抑制GH通路，另一條途徑介導(dǎo)蛋白酶體降解進(jìn)行時(shí)間依賴性抑制[12]。

CIS蛋白在GH信號通路中具有重要調(diào)控作用，其遺傳變異可能影響哺乳動物GH功能發(fā)揮，牛CIS基因mRNA長度為1 952 bp，共有3個(gè)外顯子，編碼254個(gè)氨基酸，本試驗(yàn)首次研究CIS基因5'調(diào)控區(qū)SNP與黃牛生長性狀間關(guān)聯(lián)性。威寧黃牛主要分布于貴州西部高寒山區(qū)，屬小型役肉兼用型品種，具有耐寒、耐粗飼、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)良特性[13]。威寧黃牛肉質(zhì)鮮美，蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量適中，礦物質(zhì)營養(yǎng)豐富[14]，但其生長性能需要進(jìn)一步改良提高。本研究發(fā)現(xiàn)在威寧黃牛母畜中，A-726G與體直長、胸圍、胸寬、腰高、坐骨端寬有顯著關(guān)聯(lián)，AA型個(gè)體多項(xiàng)生長性能指標(biāo)均最高，公畜群體中也與胸寬有顯著關(guān)聯(lián),CIS基因是否與哺乳動物性腺激素分泌有關(guān)需深入探究。本研究首次證實(shí)了CIS基因多態(tài)性與貴州黃牛生長性狀有關(guān)聯(lián)，A-726G突變可能是重要的功能突變位點(diǎn)，這一結(jié)論對肉牛選種選育具有重要意義，對CIS基因SNP研究結(jié)果為進(jìn)一步分析CIS啟動子功能和闡明CIS蛋白對黃牛生長所起作用奠定基礎(chǔ)。

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AssociationofPolymorphisminPromoterRegionofCISgenewithGrowthTraitsinWeiningCattle

JIANG Hui-mei1,ZHANG Yi-ling1,ZHANG Gui-xiang1,YUAN Jun1,YANG Yong-qiang2,LIU Ruo-yu2*

(1.BijieAnimalScienceandTechnologyExtensionStation,BijieGuizhou,551700;2.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversity/KeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion,MinistryofEducation,GuiyangGuizhou,550025,China;)

In order to study the correlation between the SNP in the promoter region of CIS gene and growth traits in cattle,a total of 106 Weining cattle were selected in this study.PCR-SSCP and DNA sequencing methods were used to analyse the association between SNP and specific growth traits.Results showed that various genotypes existed in different animals for the SNP of A-726G.For the female cattle populations,A-726G had significant effects on body length,heart girth,chest width,hip height and hucklebone width,with a highly significant effect on chest width,and the individuals with AA genotype had significantly higher mean value for those traits.Additionally,for the male cattle populations,A-726G had significant effect on chest width (P<0.05).It indicated that A-726G is an important functional SNP site that affect the cattle growth performance.This could lay an experimental foundation for the identification of function of CIS gene in cattle.

CIS; SNP; promoter; Weining cattle

2014-01-24，

2014-03-24

貴州省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合重大專項(xiàng)字[2011]6009號)

蔣會梅(1963-)，女，貴州人，高級畜牧師，本科，研究方向：動物遺傳育種。E-mail:jhm9088@163.com

*[通訊作者]劉若余(1963-)，男，湖南邵東人，教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士，研究方向：分子遺傳與動物育種。 E-mail：liury04@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0013-04