黃芪提取液發(fā)酵枯草芽孢桿菌工藝優(yōu)化研究

喬宏興，史洪濤，張帥帥，邊傳周*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 生物工程系，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

黃芪提取液發(fā)酵枯草芽孢桿菌工藝優(yōu)化研究

喬宏興1，史洪濤2，張帥帥1，邊傳周1*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 生物工程系，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為研究黃芪提取液發(fā)酵枯草芽孢桿菌的工藝流程，將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以1%的比例分別接入含黃芪提取液濃度為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別取24 h、48 h、72 h的培養(yǎng)物檢測(cè)菌液數(shù)量、芽孢形成率和OD值。對(duì)初篩的培養(yǎng)基配方選取接種量、pH、溫度和搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)觀察影響發(fā)酵的主要因素并進(jìn)行發(fā)酵罐大量培養(yǎng)。結(jié)果表明：含60%黃芪提取液芽孢數(shù)量最高可達(dá)1.70×109，芽孢形成率99%，OD值為2.961。正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化條件為接種量10%，pH9.0，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果48 h即可發(fā)酵結(jié)束，芽孢數(shù)量比搖瓶培養(yǎng)高5倍左右。

黃芪；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵

枯草芽孢桿菌是飼料中常用的一種添加劑，具有維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、提高生產(chǎn)性能等作用[1]。黃芪是常用的一種中草藥，味甘、性溫，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、脫毒排膿和生肌等功效[2-3]，其有效成分黃芪多糖已被證實(shí)具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[3]。傳統(tǒng)的合生元是簡(jiǎn)單的將益生菌與植物多糖組合在一起，雖然在臨床中也起到了一定的作用，但是并沒(méi)有充分發(fā)揮出微生物發(fā)酵的巨大潛力。黃芪多糖具有發(fā)酵益生菌的作用，同時(shí)能提高中藥活性成分含量、提高藥效和降低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。目前研究大多采用黃芪多糖發(fā)酵益生菌，黃芪中的其他有效活性成分并未充分發(fā)揮作用，黃芪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的研究報(bào)道較少。本研究以補(bǔ)益類中藥黃芪提取液與枯草芽孢桿菌之間具有生物活性協(xié)同作用為依據(jù)，進(jìn)行黃芪發(fā)酵枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝研究，(擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題)旨在通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高微生態(tài)制劑中芽孢的數(shù)量，為大規(guī)模生產(chǎn)降低生產(chǎn)成本，提高制劑的生防效果，為開展獸用中藥的益生菌體外轉(zhuǎn)化技術(shù)、中獸藥的創(chuàng)新提供新技術(shù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

本試驗(yàn)用黃芪購(gòu)于鄭州市晟昊大藥房；枯草芽孢桿菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系生物技術(shù)教研室保存；普通培養(yǎng)基按照常規(guī)方法進(jìn)行配制[5]；20 L不銹鋼發(fā)酵罐由鎮(zhèn)江東方生物技術(shù)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 黃芪提取液制備

稱取適量的潔凈黃芪，分別加5倍量、3倍量、2倍量水煮沸三次，每次30 min，分別取留每次煮沸濾液，最后合并三次濾液為黃芪提取液。

1.3 菌種的活化

將枯草芽孢桿菌甘油凍存管菌種接入液體普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以1%的量接種于固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)48 h后備用。

1.4 黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以制備的黃芪提取液為主，添加適量液體普通肉湯、(NH4)2SO4、NaOH設(shè)計(jì)8種發(fā)酵培養(yǎng)基(由預(yù)試驗(yàn)得出)，分別命名為1～8號(hào)培養(yǎng)基，黃芪提取液:液體普通肉湯按(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70)比例混合(V∶V)，另加入0.02 g (NH4)2SO4、0.04 g NaOH，各培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為9.0。將培養(yǎng)的菌種以1%的量接種于8種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃轉(zhuǎn)搖培養(yǎng)72 h。

1.5 菌體濃度的測(cè)定

菌體濃度的測(cè)定使用比濁法進(jìn)行測(cè)定，在培養(yǎng)過(guò)程中每隔12 h分別取樣，用紫外-分光光度測(cè)定OD600nm值。

1.6 平板菌落計(jì)數(shù)法的測(cè)定

對(duì)1～8號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)束后，分別取發(fā)酵液1 mL，稀釋至10-7、10-8、10-9倍(由預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出)，取0.1 mL的稀釋液涂布于普通瓊脂平板上(做兩個(gè)重復(fù))，37 ℃培養(yǎng)24 h，查出平板菌落數(shù)，根據(jù)公式：每毫升細(xì)菌數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/平板上加菌液的量(mL)來(lái)計(jì)算發(fā)酵液中細(xì)菌總量。

1.7 芽孢形成率的測(cè)定

對(duì)1～8號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)束后，按照參考文獻(xiàn)[5]介紹的方法進(jìn)行芽孢染色，染色后在顯微鏡下觀察一個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中芽孢的數(shù)量，芽孢的形成率=100%×(芽孢的數(shù)量/100)。

1.8 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以培養(yǎng)后枯草芽孢桿菌的數(shù)量為指標(biāo)，選取接種量、pH值、溫度和搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，按表1所示的條件，接種枯草芽孢桿菌，發(fā)酵時(shí)間為72 h。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，分析四個(gè)因素中主要影響發(fā)酵質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

表1 正交設(shè)計(jì)因素表Table 1 The factor table of the orthogonal design

1.9 發(fā)酵灌培養(yǎng)工藝優(yōu)化

用20 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)菌液15 L，先清洗發(fā)酵罐，空罐進(jìn)行消毒(121 ℃，30 min)，將發(fā)酵培養(yǎng)基(黃芪60%，液體普通肉湯30%、玉米粉10%，(NH4)2SO40.02%、NaOH 0.04%)裝入灌中，加入消沫劑，調(diào)節(jié)初始pH為9.0，然后進(jìn)行培養(yǎng)基的高壓滅菌，同樣為121 ℃ 30 min，接種培養(yǎng)24 h的液體菌種，調(diào)節(jié)溫度、轉(zhuǎn)速，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6 h進(jìn)行取樣檢測(cè)發(fā)酵液菌體含量和pH的變化，觀察枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

用1～8號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，分別取24 h、48 h、72 h的培養(yǎng)物進(jìn)行芽孢率、菌體濃度和芽孢菌總量的測(cè)定。

由表2知，黃芪提取液在發(fā)酵培養(yǎng)基中為60%的時(shí)候，菌體的總量是最多的，可以達(dá)到1.70×109，培養(yǎng)基全是黃芪提取液的時(shí)候，芽孢菌不會(huì)生長(zhǎng)，可能是黃芪提取液中的一些物質(zhì)會(huì)抑制芽孢菌的生長(zhǎng)，隨著黃芪提取液含量的下降，芽孢菌體數(shù)量會(huì)增多，但在添加含量低于60%以后，菌體的總量又會(huì)開始下降。在芽孢形成率方面，一般在24 h即可生成90%左右，到48 h基本可以全部生成芽孢，而72 h與48 h在形成芽孢率方面無(wú)有多大區(qū)別。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)驗(yàn)證

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。 由表3可知，采用相同培養(yǎng)基，9個(gè)組合中第4個(gè)組合的活菌數(shù)最高，為9.8325 Log cfu/mL(Log 106.8×109cfu/mL)，組合3的活菌數(shù)最低7.8388 Log cfu/mL(Log 106.9×107cfu/mL)，最高活菌數(shù)的倍數(shù)是最低活菌數(shù)的1.25倍。其他組合條件下的活菌數(shù)為7.8976 Log cfu/mL(Log 107.9×107cfu/mL)～9.7709 Log cfu/mL(Log 105.9×107cfu/mL)，由此確定第四個(gè)組合：即接種量10%，pH9.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速250 r/min為正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)組合。由極差R值可以看出，極差越大說(shuō)明對(duì)活菌數(shù)量的產(chǎn)生影響越大，在四個(gè)條件中，pH的極差最大為5.6635，說(shuō)明pH的大小是影響活菌數(shù)的主要因素。溫度的極差最小為0.0507，說(shuō)明在三個(gè)溫度條件中，溫度的差別對(duì)活菌數(shù)的產(chǎn)生影響最小。

2.3 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程菌體數(shù)量和pH的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1知，搖瓶培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)穩(wěn)定期其菌數(shù)可相差5倍左右，而且從發(fā)酵罐培養(yǎng)來(lái)看，發(fā)酵后24 h就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h就可進(jìn)入穩(wěn)定期，而搖瓶培養(yǎng)，其生長(zhǎng)培養(yǎng)沒(méi)有很明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其菌數(shù)增長(zhǎng)緩慢，72 h才能達(dá)到1.70×109個(gè)/mL,發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)更快，發(fā)酵時(shí)間可縮短為48 h即可，大大提高了發(fā)酵速度和效果。由圖2知，發(fā)酵液的pH從最初的9.0開始下降，到18 h后下降為6.5并一直穩(wěn)定到后期。

表2 黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選結(jié)果Table 2 Results of preparation of Astragalus fermentation medium

表3 L9(34)正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 The scheme and result of the orthogonal test L9(34)

3 討 論

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)以黃芪提取液不同的添加比例于普通培養(yǎng)基中進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，結(jié)果證明添加60%的黃芪提取液時(shí)芽孢菌的數(shù)量最高，使用黃芪提取液全培養(yǎng)物則不能生長(zhǎng)，說(shuō)明黃芪提取液不能提供給芽孢菌生長(zhǎng)所需要的碳源、氮源，也可能是黃芪提取液中的某些有效成分濃度較高的時(shí)候會(huì)抑制芽孢菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)選取高濃度的黃芪提取液，并未選取低濃度的黃芪，主要是因?yàn)橐恍┭芯孔C實(shí)低濃度的黃芪多糖能有效提高芽孢菌的數(shù)量，高濃度的黃芪多糖能抑制芽孢菌的生長(zhǎng)[9-10]，本試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)與一些研究成果有所不同，黃芪提取液只有在濃度特別高的時(shí)候抑制芽孢菌的生長(zhǎng)，當(dāng)濃度下降的時(shí)候則有利于芽孢菌的生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果的不同可能與所用的菌株不同有關(guān)，具體機(jī)理和作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。在本試驗(yàn)中，芽孢菌的芽孢形成率可達(dá)到90%以上，而且24 h之后即可生成芽孢，這對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)和進(jìn)行商品芽孢制劑的開發(fā)非常有用。

圖1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌體數(shù)量動(dòng)態(tài)變化 Fig.1 Development of thalli quantity for Bacillus subtilis

圖2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵pH動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Development of pH for Bacillus subtilis

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

發(fā)酵是指微生物細(xì)胞將有機(jī)物氧化釋放的電子直接交給底物，同時(shí)釋放能量并產(chǎn)生各種不同的代謝產(chǎn)物，以有機(jī)物為最終電子受體的生物氧化過(guò)程，是部分厭氧微生物和兼性厭氧微生物在無(wú)氧環(huán)境中獲得能量的途徑[11-13]。本試驗(yàn)中利用正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定枯草發(fā)酵最佳生長(zhǎng)條件為接種量10%，pH9.0，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min。與搖瓶培養(yǎng)時(shí)菌體的數(shù)量相比可增加10倍左右，這是因?yàn)閾u瓶培養(yǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)菌數(shù)量的增加pH不斷下降，發(fā)酵液中產(chǎn)生的糖被利用產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，pH值下降的緣故。在優(yōu)化條件中也可以看出，對(duì)本株枯草芽孢桿菌影響作用較大的因素是pH，初始pH的大小對(duì)芽孢菌的數(shù)量產(chǎn)生影響比較大。

3.3 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基配方是影響微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，不同的細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求是不同的[14-15]，而工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵還要考慮到生產(chǎn)成本的因素，對(duì)于培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該遵循原料取材方便，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉的原則，因此如何把農(nóng)副產(chǎn)品作為芽孢菌的培養(yǎng)材料從而選擇適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方是非常重要的，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)證明，玉米粉農(nóng)副產(chǎn)品應(yīng)用于發(fā)酵罐培養(yǎng)既節(jié)約了生產(chǎn)成本，又增加了枯草芽孢桿菌的數(shù)量，芽孢形成的時(shí)間短而且形成率高，篩選出比較適合工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，為該菌實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提供了基礎(chǔ)，對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基的體系仍需進(jìn)一步完善。

4 結(jié) 論

黃芪提取液在發(fā)酵培養(yǎng)基中為60%時(shí)，菌體總量最多，可達(dá)到1.70×109，芽孢形成率90%左右。正交試驗(yàn)結(jié)果表明接種量10%，pH9.0，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min為篩選出的最優(yōu)組合。搖瓶培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)其菌數(shù)可相差5倍左右，發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)更快，發(fā)酵時(shí)間可縮短為48 h，大大提高發(fā)酵速度和效果。發(fā)酵液pH值從最初9.0開始下降，到18 h后下降為6.5并一直穩(wěn)定到后期。根據(jù)本研究結(jié)果為枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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北京大學(xué)圖書館《中文核心期刊要目總覽》(第六版)業(yè)已由北京大學(xué)出版社出版，《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》入編中文核心期刊之畜牧、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、狩獵、蠶、蜂類的核心期刊。

《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》自1980年創(chuàng)刊以來(lái)，堅(jiān)持展示家畜生態(tài)研究成果，指導(dǎo)生態(tài)牧業(yè)發(fā)展，促進(jìn)畜牧生產(chǎn)與環(huán)境和諧的辦刊宗旨，倡導(dǎo)綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的畜禽健康養(yǎng)殖理念，努力提升我國(guó)家畜生態(tài)學(xué)科研究水平，刊物質(zhì)量穩(wěn)步提高。目前該刊為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊(中國(guó)科技核心期刊)、中國(guó)核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、《中國(guó)農(nóng)業(yè)文摘-畜牧》固定引用源期刊、中國(guó)期刊網(wǎng)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤版)固定源期刊、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院《中文科技資料·農(nóng)業(yè)》收錄源期刊。

ResearchOnOptimizingAstragalusExtractionLiquidFermentationTechnologyofBacillussubtilis

QIAO Hong-xing1，SHI Hong-tao2，ZHANG Shuai-shuai1，BIAN Chuan-zhou1*
(1.DepartmentofBioengineering,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,ZhengzhouHenan450011,China;2.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity，ZhengzhouHenan450002,China)

This experiment was to research Astragalus extraction liquid fermentation technology ofBacillussubtilis.Bacillussubtilisactivated with a ratio of 1% was connected with Astragalus extract with concentrations of 100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30% in liquid medium at 37 ℃for culturing respectively.After 24 h,48 h,72 h,the bacteria liquid quantity,spore forming rate and OD value were detected.Under the four factors of inoculation amount,pH value,temperature and shaking speed,the culture medium screened was taken to do the orthogonal experiment to observe the main element affecting the fermentation,and then fermenting in large scale in the fermentation tank.The results showed that: 60% Astragalus extract contained up to 1.70×109spores,with a spore forming rate of 99%,OD value being 2.961.The results of orthogonal test revealed the optimal conditions being 10% inoculation quantity,ed pH 9.0,temperature 37 ℃,and speed 250 r/min.The results for culturing in fermentation tank showed that the fermentation terminates at 48 h,with the amount of spores 5 times more than that of shaking flask culture.This study provides the experimental data for industrial production ofBacillussubtilis.

astragalus;Bacillussubtilis; fermentation

2014-02-28，

2014-03-24

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102310034)；河南省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(142201110029)

喬宏興(1976-)，男，河南長(zhǎng)垣人，碩士，副教授，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)。E-mail:zzmzqhx@163.com

*[通訊作者]邊傳周(1966-),男，河南商丘人，教授，碩士，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)。E-mail:chuanzhou-bian@126.com

S811.6

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1005-5228(2014)07-0058-05