彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中NF-κB p65、P-gp、CYP3A4表達(dá)變化及意義

朱 斌，潘韶英，趙 紅，丁志勇

(上海市第六人民醫(yī)院南院奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海 201499)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是一種最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其侵襲性強，病理特征具有高度異質(zhì)性［1，2］。據(jù)統(tǒng)計，約 40%的 DLBCL患者可通過聯(lián)合化療實現(xiàn)完全緩解，但仍有＞50%的患者對化療反應(yīng)較差，尤其是因多藥耐藥(MDR)導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或進(jìn)展，預(yù)后不佳［3］。MDR發(fā)生機制較為復(fù)雜，學(xué)者認(rèn)為其主要與腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、P-糖蛋白(P-gp)、細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4)等耐藥相關(guān)基因及蛋白有關(guān)［4］。本研究觀察了 DLBCL 組織中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院病理科2007年1月～2011年12月86例結(jié)內(nèi)病變的DLBCL組織樣本，臨床資料齊全，獲得隨訪。患者均經(jīng)手術(shù)及組織病理學(xué)確診，術(shù)前均未接受任何放射治療或化學(xué)治療。其中男49例，女37例;年齡25～76歲，中位年齡57歲。組織分型:中心母細(xì)胞變異型37例、免疫母細(xì)胞變異型29例，間變型20例。按照Ann Arbor分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期33例。預(yù)后相關(guān)的淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)［5］低危(0～2)49例，高危(3～5)37 例。選擇同期我院手術(shù)切除的性別、年齡相匹配的30例反應(yīng)增生性淋巴結(jié)患者的組織標(biāo)本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 采用免疫組化SP法。將標(biāo)本用10%甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm厚切片;常規(guī)脫蠟、水化、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)抗原熱修復(fù)。兔抗人NF-κB p65單克隆抗體、鼠抗人CYP3A4單克隆抗體、鼠抗人P-gp單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物科技有限公司，采用試劑盒已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗體作為陰性對照。NF-κB p65、P-gp、CYP3A4的判定標(biāo)準(zhǔn):隨機選擇10個高倍鏡視野(×400)計數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。采用許良中等［6］的計分方法對陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色程度進(jìn)行計分，兩項積分乘積≥2為陽性。

1.2.2 隨訪方法 對所有患者通過門診或電話形式進(jìn)行隨訪，隨訪日期從患者出院日期截至2013年12月30日或至患者死亡。隨訪內(nèi)容包括患者的一般狀況、生活質(zhì)量及近期復(fù)查情況。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SAS8.2統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表達(dá)比較 DLBCL組織中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4陽性表達(dá)率分別為 62.8%、57.0%、33.7%，淋巴增生組織中分別為23.3%、20.0%、13.3%，P 均 ＜0.05。

2.2 DLBCL 組織中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 DLBCL組織中NF-κB p65表達(dá)與IPI、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，P-gp表達(dá)與結(jié)外病灶數(shù)、臨床分期有關(guān)(P均 ＜0.05)，CYP3A4表達(dá)與IPI、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)。見表1。

表1 DLBCL 組織中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 DLBCL 組織中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表達(dá)的關(guān)系 DLBCL組織中 NF-κB p65與 P-gp、CYP3A4 表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.593、0.452，P 均＜0.05)，P-gp、CYP3A4 表達(dá)之間無顯著相關(guān)性(r=0.155，P ＞0.05)。

2.4 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表達(dá)與患者生存時間的關(guān)系 隨訪20～60個月，平均40個月。NF-κB p65、P-gp、CYP3A4陽性表達(dá)者2年總生存率分別為25.0%、36.7%、31.0%，均顯著低于陰性表達(dá)者的68.8%、64.9%、68.4%，P 均 ＜0.05。

3 討論

目前，DLBCL的發(fā)病機制尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為DLBCL的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、異質(zhì)性的過程，涉及多種遺傳信息的異常，從而誘發(fā)各種信號通路的失活或異常激活，引起細(xì)胞周期、增殖、分化及凋亡的異常，最終促進(jìn)DLBCL的發(fā)生與發(fā)展［7］。現(xiàn)已明確，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用是抗癌藥物的重要機制，而NF-κB是目前認(rèn)為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的生物因子，其中活化的NF-κB是腫瘤細(xì)胞發(fā)生、進(jìn)展及耐藥的關(guān)鍵因素［8，9］。但多種基因、信號途徑和調(diào)控機制的參與使得單一基因或分子無法準(zhǔn)確反映腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性［10］。

本研究結(jié)果顯示，DLBCL組織中NF-κB p65、P-gp及CYP3A4陽性表達(dá)率均高于淋巴增生組織，且其陽性率隨DLBCL臨床分期的增高而增高，提示這3個指標(biāo)對于判斷DLBCL的惡性程度、浸潤及轉(zhuǎn)移具有一定價值。本研究未發(fā)現(xiàn)NF-κB p65與結(jié)外病灶數(shù)相關(guān)，可能與DLBCL的異質(zhì)性有關(guān)，也可能與本研究樣本量較少有關(guān)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織NF-κB p65、P-gp表達(dá)呈正相關(guān)，說明二者存在一定協(xié)同作用，共同參與腫瘤耐藥的產(chǎn)生。Bentires-Alj等［11］研究指出，NF-κB 作為一種重要的 NF，調(diào)控MDR1等諸多基因的表達(dá);抑制人結(jié)直腸腺癌HCT-15細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，可有效減少MDR1 mRNA、P-gP 表達(dá)。本研究中，NF-κB p65、CYP3A4表達(dá)呈正相關(guān)。大量研究證實，P-gp與CYP3A4存在廣泛底物重疊，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇、秋水仙堿、環(huán)孢素、尼卡地平、維拉帕米、依托泊苷、紫杉醇等均為P-gp和CYP3A4的共同底物。當(dāng)藥物排出減少時，細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積引起CYP3A4酶的競爭性抑制，或P-gp抑制劑本身即為CYP3A4抑制劑。本研究未發(fā)現(xiàn) P-gp與 CYP3A4的表達(dá)相關(guān)，與 Masahiko等［12］研究結(jié)果一致，可能與樣本量較少有關(guān)。

目前認(rèn)為，DLBCL預(yù)后與諸多因素有關(guān)，IPI被視為指導(dǎo)臨床治療及預(yù)后評估的重要參考指標(biāo)，但因其所能反映的并非疾病的本質(zhì)，且由于DLBCL是一種高度異質(zhì)性的疾病，不同的病理亞型、發(fā)病機制也不相同，導(dǎo)致即使IPI相同的患者亦可造成截然不同的結(jié)局。因此，在IPI的基礎(chǔ)上，與一些分子預(yù)后指標(biāo)相結(jié)合，探索并建立一個高效的預(yù)后評價模式，為個體化治療提供更多的理論基礎(chǔ)，對于指導(dǎo)DLBCL治療有極高的價值。隨訪發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65、P-gp、CYP3A4陽性表達(dá)者2年總生存率均顯著低于陰性表達(dá)者，說明三者陽性表達(dá)對DLBCL疾病過程具有負(fù)面作用，反之，陰性者具有生存優(yōu)勢。

綜上所述，DLBCL組織中 NF-κB p65、P-gp和CYP3A4高表達(dá)，其一定程度上反映了DLBCL的生物學(xué)異質(zhì)性、臨床分期及對治療的反應(yīng)，可能成為抑制DLBCL生長、轉(zhuǎn)移的生物靶點。

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