亮氨酸調節(jié)大鼠胰島素分泌的功能研究

童 星，董加毅，鄔志薇，徐加英，秦立強，*

(1.蘇州大學醫(yī)學部實驗中心，江蘇蘇州215123;2.蘇州大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院，江蘇蘇州215123;3.蘇州大學醫(yī)學部放射醫(yī)學與防護學院，江蘇蘇州215123)

維持機體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，需要胰島素的精準調控。前期實驗已發(fā)現(xiàn)乳清蛋白對胰島素抵抗有改善作用［1］，且認為可能與乳清蛋白中富含亮氨酸(Leucine，Leu)有關。亮氨酸是人體必需的支鏈氨基酸，乳清蛋白中的亮氨酸比一般食物蛋白質高出50%～75%［2］，除了作為代謝底物參與蛋白質的從頭合成外，對蛋白質、脂肪和碳水化合物三大營養(yǎng)素代謝也起到重要的調控作用［3－4］。近幾年，亮氨酸的營養(yǎng)新功能備受關注。研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸能改善肥胖、代謝綜合癥人群以及高脂誘導的肥胖大鼠的胰島素抵抗和葡萄糖代謝，另外通過飲水給予小鼠較高濃度的亮氨酸，可增強其胰島素的敏感性［5－6］。然而，也有報道稱過量的亮氨酸通過抑制胰島素早期功能的發(fā)揮而導致胰島素抵抗［7－8］。因此，補充亮氨酸對機體胰島素敏感性的影響尚無一致結論，這可能和亮氨酸給予量、時間以及研究對象所處的狀況等有關［9－10］。目前我國關于亮氨酸對正常機體胰島素調節(jié)作用的研究較少，亮氨酸在高危人群中能否起到預防作用還不得而知。因此，研究亮氨酸對正常機體的調節(jié)功能是十分有必要的。本研究通過體內和體外兩個層面，觀察了亮氨酸對離體胰島細胞的胰島素分泌的影響，并通過動物實驗證實亮氨酸對正常大鼠胰島素水平和糖耐量的作用，為探討亮氨酸調節(jié)正常機體胰島素分泌和糖代謝提供實驗依據(jù)，同時也為亮氨酸預防糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病提供理論依據(jù)。這對于進一步開發(fā)以氨基酸為基礎的功能食品具有重要的現(xiàn)實意義。

表1 亮氨酸對低/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島細胞分泌胰島素的影響Table 1 Effect of leucine on insulin secretion of rat islet cells in DMEM containing low/high glucose

表2 各組大鼠血糖和胰島素AUC的比較Table 2 Comparison of the AUC of plasma glucose and insulin in different groups

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6周齡的雄性健康Wistar大鼠 購自中國科學院上海實驗動物中心;亮氨酸和膠原酶Ⅴ Sigma公司;Hanks液和DMEM培養(yǎng) GIBICO公司;血糖試紙 德國羅氏公司。

大鼠用胰島素ELISA試劑盒 美國Millipore公司;活力型血糖儀 德國羅氏公司;酶標儀 美國BIO－TEK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠胰島細胞分離和亮氨酸刺激后的胰島素測定 腹腔注射4%水合氯醛(1mL/100g)麻醉大鼠，腹正中線切口充分暴露膽總管，結扎膽總管十二指腸端，穿刺膽總管，緩慢注入預冷的0.5mg/mL膠原酶Ⅴ溶液8～10mL，使胰腺充分膨脹，迅速剪取胰腺，移入預置6mL Hanks液的培養(yǎng)瓶中，38℃水浴靜止消化10min，振蕩使其呈細砂狀，加入4℃含10%胎牛血清的 Hanks液終止消化。不銹鋼濾網(wǎng)(600μm)過濾后800r/min離心1min，棄上清，Hanks液洗滌離心2遍，收集沉淀。雙硫腙染色判斷胰腺細胞。將所收集到的胰島細胞懸液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育60min，使胰島細胞適應實驗用培養(yǎng)基的改變。24孔培養(yǎng)板中分別加入 500μL低糖(5.6mmol/L)/高糖(25mmol/L)DMEM培養(yǎng)基，再加入200μL胰島細胞懸液和不同濃度的亮氨酸(0、10、20mmol/L)，每組6個平行樣。孵育120min后吸取上清用大鼠用胰島素ELISA試劑盒測定胰島素水平。該實驗共進行了3次重復實驗。

1.2.2 大鼠分組和亮氨酸灌胃后血糖和胰島素水平的測定 將24只大鼠隨機分為4組(n=6)，禁食過夜后分別用生理鹽水(對照組，Con)、2g/kg葡萄糖(Glu組)、1.5g/kg亮氨酸(Leu組)、葡萄糖+亮氨酸(Glu+Leu組)灌胃。對照組的生理鹽水灌胃量為1mL，葡萄糖和亮氨酸分別用蒸餾水配成50%和20%的濃度，Glu+Leu組是葡萄糖和亮氨酸同時溶于蒸餾水，達到灌胃所需量。于灌胃前(即空腹)、灌胃后30、60、120min割尾取血用血糖儀測定血糖，離心取血漿測定胰島素水平，并計算血糖和胰島素曲線下面積(AUC)。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，結果以平均值±標準差±s)表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 亮氨酸對大鼠胰島細胞胰島素分泌的影響

低糖和高糖培養(yǎng)基中胰島素水平無顯著差異。低糖培養(yǎng)基中添加亮氨酸，胰島素水平無明顯變化。高糖培養(yǎng)基中添加亮氨酸后培養(yǎng)基中胰島素水平升高，并呈劑量反應關系。和對照(不添加亮氨酸)比較，高糖培養(yǎng)基添加10mmol/L亮氨酸后胰島素水平有上升趨勢，但無顯著性差異(p＞0.05)，添加20mmol/L亮氨酸則胰島素顯著升高(p＜0.05)(表1)。

2.2 亮氨酸對正常大鼠胰島素和血糖水平的影響

大鼠灌胃后，Leu組大鼠血糖和胰島素水平與Con組無明顯差異。和Con組比較，Glu組的血糖顯著升高(p＜0.01)，同時伴有胰島素水平的上升(p＜0.05)。Glu+Leu組和Con組比較，血糖和胰島素水平均顯著升高(p＜0.01)。和Glu組比較，Glu+Leu組顯著增加了30min時胰島素的分泌(p＜0.01)(圖1A);同時顯著降低了60、120min的血糖(p＜0.05)(圖1B)。和Con組比較，Leu組胰島素AUC和血糖AUC均無明顯變化;而Glu組和Glu+Leu組的胰島素AUC及對應的血糖AUC顯著增加(p＜0.01)。與Glu組比較，Glu+Leu組胰島素AUC值顯著增加(p＜0.01)，相應地血糖AUC值降低(p＜0.05)(表2)。

圖1 亮氨酸對正常大鼠胰島素(A)和血糖(B)水平的影響Fig.1 Effect of leucine on levels of insulin(A)and plasma glucose(B)in normal rats

3 結論與討論

亮氨酸的營養(yǎng)新功能受到廣泛關注，其中包括調節(jié)胰島素分泌并影響胰島素抵抗［4］。本研究中只有在高糖培養(yǎng)基中添加亮氨酸，離體的大鼠胰島細胞懸液中胰島素水平顯著升高，提示在一定濃度葡萄糖下亮氨酸刺激胰島素釋放。Brouwer很早就觀察到亮氨酸刺激胰島素分泌的作用［11］，在和我們研究相同濃度(20mmol/L)亮氨酸刺激下，添加了22.2mmol/L葡萄糖的胰島離體細胞中胰島素分泌增加，而添加27.7mmol/L葡萄糖則降低了胰島素分泌。我們的研究中，25mmol/L葡萄糖濃度介于兩者之間(22.2～27.7mmol/L)，仍然發(fā)現(xiàn)胰島素分泌的增加。亮氨酸刺激刺激離體胰島分泌胰島素所需的葡萄糖濃度存在一個范圍，需要設計更多的濃度組加以觀察。

在動物實驗中，單獨給予亮氨酸對血糖和胰島素無影響，這和大鼠離體胰島的研究結果一致。但是在攝取葡萄糖的同時給予亮氨酸，進一步升高了葡萄糖負荷后30min的胰島素水平，并降低了60、120min的血糖水平?？偟膩碚f，通過表2實驗結果可得出，同時給予葡萄糖和亮氨酸與單獨攝取葡萄糖相比，其血漿胰島素AUC增加27%，血糖AUC減少8%。Kalogeropoulou用健康成人作為觀察對象得到相似的結果［12］，即單獨攝入亮氨酸沒有影響血清葡萄糖水平，當和葡萄糖一起攝取，2.5h血糖AUC降低了50%。因此，我們的離體和在體實驗都證實了亮氨酸能夠促進葡萄糖刺激的胰島素釋放，隨之降低了葡萄糖負荷后的血糖水平。

亮氨酸主要通過以下兩個途徑促進胰島素分泌。一是亮氨酸通過轉氨作用形成α－酮異己酸，促進線粒體氧化;其次，亮氨酸通過自身氧化脫羧，變構激活谷氨酸脫氫酶為三磷酸循環(huán)提供原料。兩者都最終促進胰島素釋放［3］。

本研究探討了亮氨酸的急性效應，雖然一些研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸攝取有利于控制肥胖，改善糖代謝和胰島素抵抗［5－6］，但 Liu 等在小鼠離體胰島細胞和INS－1E細胞加入亮氨酸72h后，葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，導致胰島β細胞的功能損傷［13］。Zanchi用地塞米松誘導大鼠胰島素抵抗，在給予較高劑量的亮氨酸的情況，進一步增加了胰島素抵抗，出現(xiàn)了糖尿病癥狀［9］。因此，亮氨酸作用于機體的長期效應還有待進一步研究。

綜上所述，亮氨酸促進葡萄糖依賴的胰島素的一過性釋放，從而降低血糖水平。因此，要發(fā)揮亮氨酸調節(jié)胰島素分泌的功能，通過攝取亮氨酸或者富含亮氨酸的蛋白質來刺激胰島素釋放時需要攝取一定量的碳水化合物，這也為亮氨酸的開發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。

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