熒光定量PCR法檢測乙肝病毒DNA和乙肝病毒標(biāo)志物檢測的臨床價值分析

陳海雁, 張桂花, 羅錦彬, 黃舒婷

(廣東省惠州市惠陽區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科, 廣東 惠州, 516211)

乙型肝炎是中國常見傳染性疾病之一，也是較嚴(yán)重的病毒性肝炎之一，嚴(yán)重危害人們的生活健康和生活質(zhì)量[1]。乙肝病毒標(biāo)志物(HBV-M)是目前中國臨床判斷病情及傳染性的一項重要參考依據(jù)，能夠反映患者對HBV病毒的免疫應(yīng)答狀態(tài)[2]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在臨床診斷和治療中發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢，其可直接檢測患者的HBV-DNA病毒含量，反映HBV復(fù)制及感染活性[3]。本研究通過HBV-M定性及HBV-DNA定量檢測，探討二者之間的關(guān)系及臨床價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

選取2013年4—12月在本院檢測的乙肝患者653例，診斷標(biāo)準(zhǔn)：肝組織Knodell HAⅠ≥4，或≥G2/S2炎性壞死/纖維化，ALT≥2×ULN, 同時HBV-DNA呈陽性。男412例，女243例，年齡5～66歲，平均(36.42±6.45)歲, HBV-DNA檢測試劑主要由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)，采用ROCHELIGHTCYCLER480型號的基因擴(kuò)增分析儀; ELISA試劑盒購自上?？迫A公司。質(zhì)控品由臨檢質(zhì)控中心提供。

HBV免疫學(xué)檢測：取受試者肘靜脈血5 mL室溫靜置30 min, 離心5 min(25 cm, 3 000 rpm),采用ELISA法進(jìn)行HBV-M模式的定性檢測。檢測順序為: ① HBsAg; ② HbsAb; ③ HbeAg; ④ HbeAb; ⑤ HbcAb。根據(jù)上海熱電MK3型酶標(biāo)儀比色進(jìn)行結(jié)果評定，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行檢驗操作及評定結(jié)果。

HBV-DNA定量測定：采用FQ-PCR法對HBV-DNA病毒含量進(jìn)行測定。儀器型號為ROCHELIGHTCYCLER480型號(購自德國羅氏公司),FQ-PCR試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，定量測定范圍在103～107，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，結(jié)果真實可信。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA檢測HBV-M模式結(jié)果

本研究653例乙肝患者的血液標(biāo)本中，HBV-M模式定性檢測有以下8種模式：大三陽(1、3、5模式)197例，小三陽(1、4、5模式)252例，1、4模式95例，1、3模式19例，2、4、5模式25例，2、4模式13例，4、5模式19例，5模式33例。

2.2 HBV-DNA定量檢測結(jié)果

以HBV-DNA表達(dá)水平高于1×103copies/mL為陽性。本研究653例血清樣本中，HBV-DNA檢測陽性率為54.82%(358/653)。

2.3 不同HBV-M模式下檢測結(jié)果比較

大三陽(1、3、5模式)和1、3模式的HBV-DNA陽性率分別為97.97%和94.74%，顯著高于其他模式(P<0.05)。大三陽(1、3、5模式)的HBV-DNA表達(dá)水平為(5.59×106±2.42×105), 顯著高于其他模式(P<0.05)，見表1。

2.4 不同HBV-M模式HBV-DNA含量公布

以HBV-DNA表達(dá)水平進(jìn)行分組，陰性組HBV-DNA<103; 低水平復(fù)制組HBV-DNA103～<104; 中水平復(fù)制組HBV-DNA104～<106: 高水平復(fù)制組HBV-DNA107～<109。不同HBV-M模式HBV-DNA表達(dá)水平分布見表2。

表1 不同HBV-M模式下檢測結(jié)果比較

表2 HBV-M模式HBV-DNA含量分布比較

3 討 論

中國流學(xué)病學(xué)調(diào)查表明，一般人群HBsAg陽性率約為9.1%，感染慢性乙肝病毒患者發(fā)生原發(fā)性肝癌危險性增加約3 000倍[4]。由于HBV感染具有極強(qiáng)的傳染力，臨床發(fā)病率較高，且部分患者易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，在疾病進(jìn)展過程中易繼發(fā)肝硬化、肝癌等疾病，已成為世界性的一個嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[5]。因此，尋找一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法對于HBV感染的早期診斷、切斷傳播及予以及早治療具有重要意義。

目前臨床主要的檢測方法有ELISA法、放射免疫法、FQ-PCR法以及化學(xué)發(fā)光法等[6]。ELISA法檢測只能反映患者對HBV病毒的免疫應(yīng)答狀態(tài)，是HBV病毒感染的間接參考依據(jù)，對機(jī)體HBV感染復(fù)制情況及傳染危險性反映不準(zhǔn)確[7]。而FQ-PCR法對HBV-DNA表達(dá)水平的檢測是HBV感染情況的最直接參考指標(biāo)，其檢測靈敏度、特異性較高，且能直接、動態(tài)地反映HBV病毒的復(fù)制狀態(tài)及傳染危險性[8]。但FQ-PCR法HBV-DNA定量檢測對非復(fù)制狀態(tài)下的感染情況反映不明確[9]，故臨床上常聯(lián)合檢測。

大三陽是指乙肝表面抗原、核心抗體及e抗原檢測同時陽性，即1(+)、3(+)、5(+)模式。本研究結(jié)果顯示，從不同HBV-M模式HBV-DNA陽性檢測率， 大三陽(1、3、5模式)和1、3模式的HBV-DNA陽性率分別為97.97%和94.74%, 顯著高于其他模式(P<0.05)。大三陽(1、3、5模式)的HBV-DNA表達(dá)水平最高(5.59×106±2.42×105)，明顯高于其他模式(P<0.05), 與林琳等[10]研究報道一致，說明了當(dāng)1、3同時陽性時，患者體內(nèi)HBV-DNA復(fù)制活躍，病毒傳染性增加。因此，大三陽患者的病毒傳染性強(qiáng)。本研究小三陽患者[1(+)、4(+)、5(+)模式]HBV-DNA陽性率為34.92%，顯著低于大三陽97.97%陽性率(P<0.05); 但是HBV-DNA表達(dá)水平(4.18×105±1.53×104)仍較高。說明小三陽HBeAg已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，HBV-DNA復(fù)制活躍性亦略低于大三陽組，但是機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制并未停止，仍有傳染性[11]。1(+)、3(+)模式的HBV-DNA陽性率為60%, 介于大、小三陽之間，有研究報道解釋其可能是因HBV病毒基因第1 896位核普酸出現(xiàn)突變，使得前C區(qū)序列轉(zhuǎn)錄以及翻譯受阻，因而HBeAg分泌減少，但患者HBV-DNA復(fù)制情況仍存在，臨床也應(yīng)加以重視[12]。2(+)、4(+)模式，4(+)、5(+)模式，5(+)模式的陽性率為0%。HBsAg、HBeAg轉(zhuǎn)陰，HBsAb的產(chǎn)生說明了患者體內(nèi)HBV病毒已經(jīng)清除，HBsAb在HBV病毒清除時作用較大。2(+)、4(+)、5(+)模式下，機(jī)體已經(jīng)產(chǎn)生了具有保護(hù)性作用的HBsAb, 或宿主免疫力低，既不表達(dá)抗原，也不產(chǎn)生抗體應(yīng)答，因此陽性率亦較低[13]。以上4種模式，乙肝病毒基本不復(fù)制，傳染性低。檢測中常以HBV-DNA表達(dá)水平進(jìn)行分組，陰性組(HBV-DNA<103)、低水平復(fù)制組(HBV-DNA103～<104)、中水平復(fù)制組(HBV-DNA104～<106)、高水平復(fù)制組(HBV-DNA107～<109), 進(jìn)一步以HBV-DNA表達(dá)水平進(jìn)行分組結(jié)果分析，不同HBV-M模式下陰性組、低水平復(fù)制組、中水平復(fù)制組、高水平復(fù)制組檢測出的陽性率各不相同，但結(jié)論與HBV-M不同模式下陽性檢測率完全一致。

綜上所述，不同HBV-M模式的HBV-DNA表達(dá)水平及陽性率存在顯著差異性，聯(lián)合HBV-M定性及HBV-DNA定量檢測對臨床早期診斷及用藥具有重要指導(dǎo)價值。

[1] 張浩宇, 張麗.HBV-DNA定量與乙肝標(biāo)志物結(jié)果分析對比[J].慢性病學(xué)雜志, 2010, 12(11): 1425.

[2] 葉儒軍, 魏威.乙肝病毒DNA與乙肝病毒標(biāo)志物的相關(guān)州研究[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(23): 2932.

[3] 陳鳳萍, 沈云峰, 吳瑤, 等.335例乙型肝炎患者血清HYV-DNA定量與乙肝病毒標(biāo)志物的相關(guān)性分析[J].江漢大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2012, 40(5): 93.

[4] Ganem D, Prince A M.Hepartitis B virus infeetion-natural history and cinical consequences[J].N Engl J Med, 2004, 350(11): 1119.

[5] 舒海英.兩種免疫分析方法檢測乙肝病毒血清標(biāo)志物的差異分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 41(12): 1602.

[6] 劉玉昆, 黃曉霞, 吳遠(yuǎn)萍, 等.乙肝病毒標(biāo)志物陽性產(chǎn)婦乳汁中乙肝病毒檢測結(jié)果分析[J].中國婦幼健康研究, 2011, 22(5): 581.

[7] Su H L, Huang R D, He S Q, et al.Cloning and sequence analysis of the DHBV genome of the brown ducks in Guilin region and establishment of the quantitative method for detecting DHBV[J].Reprod Biol Endocrnol, 2013, 11: 56.

[8] 秦望森, 沈立萍, 張爽, 等.乙肝患者HBV感染指標(biāo)、病毒復(fù)制水平與基因分型的關(guān)系分析[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2012, 26(5): 328.

[9] Alvarado-Mora M V, Romano C M, Gornes-Gouvea M S, et al.Phylogenetic analysis of complete genome sequences of hepatitis B virus from an Afro-Colombian community: presence of HBV F3/A1 recombinant strain[J].Virol J, 2012, 9: 244.

[10] 林琳.乙肝患者血清標(biāo)志物和病毒含量的相關(guān)性研究[J].標(biāo)記免疫分析與臨床, 2011, 18(2): 71.

[11] Chen C H, Lee C M, Wang J H, et al.Correlation of quantitative assay of hepatitis B surface antigen and HBV-DNA levels in asymptomatic hepatitis B virus carriers[J].Eur J Gastroenterol Heatol, 2004, 16(11): 1213.

[12] 唐芳玫.乙型肝炎病毒DNA與血清標(biāo)志物的關(guān)系[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 7(1): 28.

[13] 周麗敏.乙肝病毒標(biāo)志物2 431例檢測模式匯總及分析[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 11(1): 65.