臍血干細(xì)胞移植結(jié)合補益腎氣利濕法對ChildA、B級肝硬化患者免疫功能的影響

周曉玲, 謝 勝, 陳 峭, 侯秋科

(廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院 消化科, 廣西 柳州, 545001)

肝硬化是臨床常見的嚴(yán)重疾病，一直以來缺乏有效的治療手段。近年來，干細(xì)胞移植技術(shù)在治療肝硬化的治療方面取得了一定的進(jìn)展，引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。柳州市中醫(yī)院消化科應(yīng)用臍血干細(xì)胞移植治療各期肝硬化患者均取得了一定的療效[1]。同時，在長期的臨床實踐過程中我們發(fā)現(xiàn)，行臍血干細(xì)胞移植治療的同時配合補益腎氣利濕法可取得更為滿意的療效。本文擬觀察臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合補益腎氣利濕法治療ChildA、B級肝硬化患者治療前后體內(nèi)T細(xì)胞亞群、紅細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)及肝組織病理學(xué)檢查的變化情況，總結(jié)該療法的臨床療效并探討其可能的作用機(jī)制，促進(jìn)該療法在臨床的推廣應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年11月—2012年11月在柳州市中醫(yī)院住院的50例ChildA、B級肝炎后肝硬化患者為研究對象。嚴(yán)格參照《實用內(nèi)科學(xué)》第14版肝硬化的相關(guān)診斷內(nèi)容[2]進(jìn)行診斷，通過CT檢查、肝組織活檢，并根據(jù)肝硬化Child-Pugh計分及評級標(biāo)準(zhǔn)篩選病例。其中男28例，女22例；年齡27～72歲，平均(48.2±3.1)歲; Child A級30例，Child B級20例。隨機(jī)分為治療組和對照組，每組25例，2組患者的性別、年齡、Child-Pugh分級等一般資料無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。所有治療措施都在患者知情同意并簽署《知情同意書》情況下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備：患者入院后均行內(nèi)科對癥治療，行肝臟生化學(xué)、病毒學(xué)檢查、肝臟CT及肝組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 臍血干細(xì)胞移植治療: ① 臍血采集及分離：選擇足月產(chǎn)婦，產(chǎn)前檢查正常，產(chǎn)后無新生兒畸形。產(chǎn)后留臍血80～120 mL, 2～4 ℃保存, 12 h內(nèi)在萬級潔凈實驗室百級超凈工作臺內(nèi)，由從事細(xì)胞分離的專業(yè)人員按試劑盒說明書要求分離臍血干細(xì)胞; ② 移植方法及術(shù)后處理：在介入治療室內(nèi)，經(jīng)股動脈穿刺插管，置管于肝固有動脈進(jìn)行數(shù)字減影血管造影(DSA)，觀察肝內(nèi)血管情況及有無占位性病變。經(jīng)肝固有動脈將分離好的干細(xì)胞懸液10 mL緩慢注入(2 mL/min), 術(shù)畢拔管，穿刺點加壓包扎后返回病房。術(shù)后股動脈穿刺點壓迫止血12 h, 穿刺側(cè)下肢制動6 h。術(shù)后常規(guī)監(jiān)護(hù)，并繼續(xù)抗病毒、保肝及對癥支持治療。

1.2.3 補益腎氣利濕法：干細(xì)胞移植術(shù)治療前后各服用濟(jì)生腎氣湯1個月。處方：熟地黃80 g、山茱萸40 g、山藥40 g、澤瀉30 g、茯苓30 g、丹皮30 g、肉桂10 g、附子10 g、車前子20 g、牛膝20 g。以上藥物均由中藥煎煮機(jī)(天津三延公司生產(chǎn))進(jìn)行煎煮，一劑濃煎為2袋，每袋180 mL。

1.2.4 檢測方法：所有患者均清晨抽取空腹外周血2 mL, 肝素抗凝，按T細(xì)胞亞群免疫熒光檢測試劑盒(德國Partec公司)進(jìn)行操作，測定CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，結(jié)果采用FloMax專用軟件進(jìn)行分析；采用郭峰法檢測紅細(xì)胞C3b受體黏附花環(huán)率(RBCoC3bRR)、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(RBCoICR)等紅細(xì)胞免疫功能；術(shù)前及術(shù)后第12個月超聲引導(dǎo)下行肝穿刺活體組織檢查術(shù)，肝組織標(biāo)本采用中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅、網(wǎng)狀(Gorelen Sweet法)和膠原(VG法)染色，病理觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察肝組織病理切片，作出分級、分期病理診斷，并計算炎癥和纖維化計分；觀察治療前及治療后第3、6、12個月RBCoC3bRR、RBCoICR以及T淋巴細(xì)胞亞群。

2 結(jié) 果

2.1 2組肝組織病理學(xué)檢查

治療后12個月，2組炎癥計分及纖維化計分均顯著下降(P<0.01), 治療后，2組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見表1。

表1 2組治療前后肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果的比較±s, 分)

2.2 2組治療前后紅細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)比較

與治療前相比，治療后2組RBCoC3bRR、紅細(xì)胞免疫黏附促進(jìn)率(RFER)顯著升高, RBCoICR、紅細(xì)胞免疫黏附抑制率(RFIR)顯著下降(P<0.01); 治療后, 2組各指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 2組治療前后紅細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)比較±s)

2.3 2組治療前后T細(xì)胞亞群比較

與治療前相比，2組治療后外周血T細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞均顯著上升(P<0.05或P<0.01), 且治療組上升幅度更大。見表3。

表3 兩組治療前后外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果±s)

3 討 論

大量研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有橫向分化能力，在一定的條件下可分化為肝細(xì)胞和干細(xì)胞從而參與肝臟的修復(fù)與重建，這為肝硬化的治療提供了新的途徑[3]。臍血有著充足的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，免疫原性較弱，且其間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始，擴(kuò)增性能更強(qiáng)，可作為一種新的替代細(xì)胞來源，用于各系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植[4-5]。本科應(yīng)用臍血干細(xì)胞移植治療各期肝硬化療效顯著，前期研究顯示，采用臍血源性干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化患者后，其臨床癥狀明顯改善，胸、腹水消失，下肢浮腫減輕，食欲改善，乏力好轉(zhuǎn)，腹脹減輕, Child-Pugh計分較治療前明顯降低，臨床總有效率達(dá)75.6%[1]。本研究亦表明，采用臍血源性干細(xì)胞移植治療ChildA、B級肝硬化患者，其肝組織炎癥計分、纖維化計分均顯著降低，提示了肝硬化患者的肝臟炎癥得到明顯改善，肝組織纖維化程度在一定程度上逆轉(zhuǎn)，這與我們的前期研究成果亦是一致的。

T淋巴細(xì)胞亞群在肝細(xì)胞損害、機(jī)體抗腫瘤免疫中起著非常重要的作用。T淋巴細(xì)胞的兩個功能亞群，即CD4+T細(xì)胞的輔助功能亞群、CD8+T細(xì)胞的抑制及殺傷功能亞群，具有調(diào)節(jié)整個機(jī)體免疫功能的作用，其數(shù)量、比例和功能的改變都可能影響著機(jī)體的免疫狀態(tài)[6]。同樣，紅細(xì)胞具有多種非特異性免疫受體和物質(zhì)，不僅能識別、儲存、殺傷抗原、清除循環(huán)免疫復(fù)合物，還參與機(jī)體的免疫調(diào)控，在機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中占有重要的地位[7]。當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時，肝臟合成功能減退，紅細(xì)胞免疫功能受損，表現(xiàn)為以紅細(xì)胞

C3b受體降低和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物增高為主的免疫損傷[8]。研究表明，臍血干細(xì)胞移植治療后外周血T細(xì)胞亞群相關(guān)指標(biāo)得到顯著改善，RBCoC3bRR、RFER顯著提高，RBCoICR、RFIR顯著下降，提示臍血干細(xì)胞移植療法可能是通過參與T淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞等免疫調(diào)控過程而改善肝硬化。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)配合中醫(yī)補益腎氣利濕法可進(jìn)一步提高干細(xì)胞移植治療的療效。中醫(yī)藥對肝纖維化與肝硬化的治療本身就具有一定優(yōu)勢，近年來已有多個抗肝纖維化經(jīng)驗方藥與中藥新藥問世并廣泛用于臨床，其基本中醫(yī)治則為“扶正化瘀”[9]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，腎氣丸具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、影響造血系統(tǒng)等多重作用[10-11]。本研究結(jié)果亦表明，采用臍血源性干細(xì)胞移植聯(lián)合補益腎氣利濕法治療的肝硬化，患者紅細(xì)胞免疫、T細(xì)胞亞群等相關(guān)指標(biāo)得到了顯著改善，與單用臍血源性干細(xì)胞移植治療方案比較具有顯著差異(P<0.01)，且在最終的治療效果上，聯(lián)合治療方案的肝組織炎癥及纖維化程度計分改善要遠(yuǎn)優(yōu)于對照組(P<0.01)。表明補益腎氣利濕法具有強(qiáng)大的免疫調(diào)控功能，與干細(xì)胞移植同時運用可起到免疫功能協(xié)同增效的效果，并可能對干細(xì)胞移植后定植及增強(qiáng)細(xì)胞活性起到積極的調(diào)控作用。

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