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    突變型聚酮合成酶酮還原酶域的表達(dá)及序列分析

    2011-07-26 03:29:58李凌凌呂早生
    化學(xué)與生物工程 2011年8期
    關(guān)鍵詞:環(huán)己酮還原酶殘基

    李凌凌,呂早生,李 濤,沈 輝

    (武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430081)

    聚酮化合物,是廣泛存在于自然界中的結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物,具有很大的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值,包括很多抗生素和抗真菌藥。聚酮是由聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)催化一系列的小分子前體進(jìn)行重復(fù)縮合反應(yīng)而合成的。目前為止,至少有3種不同類型的聚酮合成酶[1],其中Ⅰ型聚酮合成酶是一種模塊型的多功能酶,如負(fù)責(zé)催化合成紅霉素A中大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的6-脫氧紅霉內(nèi)酯B合成酶(6-Deoxyerythronolide B synthase,DEBS),DEBS有6套結(jié)構(gòu)和功能相近的模塊,每套模塊催化完成一輪碳鏈的延伸和還原,其上有酮合成酶(Ketosynthase,KS)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyl transferase,AT)和?;d體蛋白(Acyl carrier protein,AC)3個(gè)基本酶域,且可能含有酮還原酶(Ketoreductase,KR)、脫水酶(Dehydratase,DH)和烯醇還原酶(Enoyl reductase,ER)[2]。Ⅱ型聚酮合成酶是一種可重復(fù)催化反應(yīng)的多酶復(fù)合體,負(fù)責(zé)合成芳香族聚酮,如放線菌素。聚酮合成酶中的酮還原酶屬于短鏈脫氫酶(Short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)超家族。2004年,Korman等[3]和Hadfield等[4]通過比較芳香族聚酮的酮還原酶與其它短鏈脫氫酶超家族成員的結(jié)構(gòu)差異,提出芳香族聚酮的酮還原酶(如放線菌素聚酮還原酶ActKR)與其它SDR家族成員的差異為α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基,該區(qū)域是SDR家族的底物結(jié)合口袋的一部分,是最不保守的序列,負(fù)責(zé)控制底物特異性。2006年,Keatinge-Clay等[5]研究了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶域EryKR1的結(jié)構(gòu),提出了該酶域與其它酶域間的界限、多聚體的組成方式以及控制催化立體選擇性還原反應(yīng)的機(jī)制等,但未提及該酶域的底物結(jié)合口袋等。同年Bali等[6]在大腸桿菌中異源表達(dá)了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的酮還原酶域,并研究了該酶域的底物特異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此酶域?qū)Y(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物都有活性,但該研究并沒有以這些底物進(jìn)行生物催化,得出有關(guān)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的數(shù)據(jù)。

    作者在此通過比對EryKR1酶域和ActKR酶的氨基酸序列和二維結(jié)構(gòu),根據(jù)ActKR中控制底物特異性位點(diǎn)為α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基EHYSDIWEVS,推測EryKR1酶域中控制底物特異性位點(diǎn)的氨基酸殘基,接著利用重疊PCR技術(shù),擴(kuò)增出推測的控制底物特異性位點(diǎn)的氨基酸序列,替換成ActKR對應(yīng)位點(diǎn)的EHYSDIWEVS的突變型EryKR1酶域基因eryKR1M,將此DNA片段克隆到pET-28a上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-eryKR1M,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,且研究由此獲得的重組菌株與野生型重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1)2在針對環(huán)己酮、2-辛酮、苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯進(jìn)行生物催化羰基還原上的區(qū)別,旨在研究EryKR1酶域中α6和α7間的氨基酸殘基替換對上述底物催化特異性的改變情況,進(jìn)而分析探討EryKR1酶域的底物特異性位點(diǎn)。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料

    1.1.1 菌種和質(zhì)粒

    糖多孢紅霉菌A226(SaccharopolysporaerythraeaA226)、大腸桿菌BL21、DH5α及表達(dá)載體pET-28a由安徽大學(xué)張部昌教授惠贈(zèng);E.coliBL21 (pET-gdh1)菌株(即異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因gdh的大腸桿菌重組菌)以及E.coliBL21 (pET-eryKR1)2菌株(即異源表達(dá)野生型EryKR1酶域基因eryKR1的大腸桿菌重組菌)均為自行構(gòu)建保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[7]配制,篩選抗性菌株時(shí),加終濃度100 μg·mL-1的卡拉霉素;TSB培養(yǎng)基(%):Tryptic Soy Broth 3 g,用于S.erythraea的液體培養(yǎng)[8]。

    1.1.3 工具酶和化學(xué)試劑

    限制性核酸內(nèi)切酶、蛋白酶K、RNase酶、T4DNA連接酶、IPTG,Takara公司;DNA純化和質(zhì)粒少量快速提取試劑盒,北京道普生物技術(shù)開發(fā)中心;dNTP、pfu DNA聚合酶,北京天為時(shí)代生物技術(shù)有限公司;引物合成和測序工作由上海生工公司完成;Tryptic Soy Broth,F(xiàn)ulka;4-氯乙酰乙酸乙酯(97%),Alfa Aesar;R-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(98%),AcRos;其它試劑均為國產(chǎn)。

    1.2 方法

    1.2.1eryKR1M基因的克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

    糖多孢紅霉菌A226基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道的EryKR1酶域的邊界,設(shè)計(jì)擴(kuò)增突變型eryKR1M基因的兩端引物,為便于克隆,在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),引物L(fēng)KR:5′-gccatatggacgaggtttccgcgctgcg-3′(gc為保護(hù)性堿基,catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn)),引物RKR:5′-gcggatcctcacgcgcccacccgcggttcggc-3′(gc為保護(hù)性堿基,ggatcc為BamHⅠ酶切位點(diǎn));用于擴(kuò)增中間突變位點(diǎn)的重疊PCR引物:引物ActKRL:5′-gagcactactcggacatctgggaggtgtcgcccgagac-ggcctgccgggc-3′,引物ActKRR:5′-cgacacctcccagatgtcggagtgctcgcggaagcggtcggccaccg-3′;PCR擴(kuò)增體系和條件見文獻(xiàn)[9]。獲得的PCR特異片段產(chǎn)物回收純化后,經(jīng)上海生工測序部測序,再利用NCBI的Nucleotide blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[10]進(jìn)行比對,以確認(rèn)是否為對應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生所需突變的目標(biāo)基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、載體的雙酶切及連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等分子操作,參照文獻(xiàn)[7]按常規(guī)方法進(jìn)行;PCR產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物的回收純化和質(zhì)粒小量提取按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

    1.2.2 酶的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

    將E.coliBL21(pET-eryKR1M)重組菌按1%的接種量接入到含有100 μg·mL-1卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至A600=1.0,加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG,37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,4000 r·min-1、4 ℃離心10 min,收集菌體,將收集的菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析,以檢測目的蛋白的表達(dá)量[11]。

    1.2.3 重組菌催化還原羰基底物的反應(yīng)

    雙重組菌耦合還原4種羰基底物(環(huán)己酮、2-辛酮、苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯)的反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[12]。上述轉(zhuǎn)化體系于30 ℃、100 r·min-1振蕩反應(yīng)6 h后,6000 r·min-1離心10 min,收集上清。氣相色譜檢驗(yàn)乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液上清獲得的有機(jī)相,用于分析產(chǎn)物得率。分析環(huán)己酮、苯乙酮、4-氯乙酰乙酸乙酯及2-辛酮轉(zhuǎn)化液的氣相色譜條件參照文獻(xiàn)[12]。還原反應(yīng)的產(chǎn)率按文獻(xiàn)[11]計(jì)算。

    1.2.4 序列分析

    采用DNAssist軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對,采用PSIPRED Server進(jìn)行蛋白質(zhì)的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/),采用Swiss-model進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://swissmodel.expasy.org/),以了解突變對酶的影響。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 對EryKR1酶域的序列分析

    根據(jù)Hadfield等的報(bào)道,放線菌素聚酮還原酶ActKR的底物結(jié)合口袋是由β4、β5和β6折疊的羧基端和α5的氨基端以及α6-環(huán)-α7形成,且α6和α7之間的10個(gè)氨基酸殘基是芳香族聚酮還原酶(如ActKR)和其它SDR家族成員最大的差異,決定了SDR家族成員的不同的底物特異性[4]。因此利用DNAssist軟件和PSIPRED Server對EryKR1酶域和放線菌素聚酮還原酶ActKR分別進(jìn)行氨基酸序列比對(如圖1所示)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(如圖2所示),發(fā)現(xiàn)EryKR1酶域的二級結(jié)構(gòu)(圖2b)基本符合ActKR酶的二級結(jié)構(gòu)(圖2a)的模式特點(diǎn),推測EryKR1的底物結(jié)合口袋也由α6-環(huán)-α7組成,且其中的氨基酸殘基RHGVIEMP對應(yīng)于放線菌素聚酮還原酶的α6和α7之間的10個(gè)氨基酸殘基EHYSDIWEVS,可能決定了EryKR1酶域和ActKR酶的不同的底物特異性。

    框中為α6-環(huán)-α7間的氨基酸殘基,黑色標(biāo)記是相同殘基,灰色標(biāo)記是相似殘基

    圖2 PSIPRED Server進(jìn)行的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(方框中為α6-環(huán)-α7間的氨基酸殘基)

    2.2 pET-eryKR1M重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板,以引物L(fēng)KR和ActKRR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物eryKR1M-L,再以引物RKR和ActKRL進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物eryKR1M-R,將這些PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行1.0%和2.5%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖3所示。

    1、3、5分別為eryKR1M-L、eryKR1M-R、eryKR1M的PCR回收純化產(chǎn)物 2、4、6為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

    由圖3a、3b可見,PCR產(chǎn)物eryKR1M-L位于1000~2000 bp之間,與目標(biāo)基因突變位點(diǎn)左側(cè)的序列長度(1250 bp)吻合,而片段eryKR1M-R位于200~300 bp之間,與目標(biāo)基因突變位點(diǎn)右側(cè)的序列長度(210 bp)吻合。以片段eryKR1M-L和eryKR1M-R(體積比為3∶1)為模板,再以引物L(fēng)KR和RKR進(jìn)行擴(kuò)增,利用重疊PCR獲得產(chǎn)物eryKR1M,以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖3c),片段大小位于1000~2000 bp之間,與目標(biāo)基因的序列長度(1450 bp)吻合。將eryKR1M片段克隆到pET-28a載體上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-eryKR1M。對該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖4),證實(shí)了質(zhì)粒pET-eryKR1M中克隆的基因片段與目標(biāo)片段的大小一致。

    1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 2.pET-eryKR1M重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和Bam HⅠ雙酶切產(chǎn)物

    利用NCBI提供的核苷酸比對功能,對重組質(zhì)粒的測序結(jié)果進(jìn)行序列分析,得出測序結(jié)果與登錄號為AY661566.1報(bào)道的糖多孢紅霉菌聚酮合成酶基因簇(總長為32 299 bp)中4384~5756 bp之間的堿基序列的相似度達(dá)到99%,其中AY661566.1序列中的第5572~5595個(gè)堿基aggcacggcgtcatcgagatgcct(編碼的氨基酸序列為RHGVIEMP)已替換成測序結(jié)果中的gagcactactcggacatctgggaggtgtcg(編碼的氨基酸序列為EHYSDIWEVS),如圖5所示。說明野生型eryKR1基因中編碼α6-環(huán)-α7之間的氨基酸殘基RHGVIEMP的堿基序列已突變成了放線菌素聚酮還原酶對應(yīng)位點(diǎn)EHYSDIWEVS相應(yīng)的堿基序列。

    圖5 pET-eryKR1M測序結(jié)果的核苷酸比對分析(方框標(biāo)記的是突變位點(diǎn))

    2.3 突變型eryKR1M基因的誘導(dǎo)表達(dá)

    表達(dá)載體pET-eryKR1M轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)后,獲得了E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌,以E.coliBL21 (pET-28a)菌為陰性對照,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果見圖6。

    1、3、4分別為IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21(pET-28a)、E.coli BL21(pET-eryKR1)2、E.coli BL21(pET-eryKR1M)的全蛋白 2.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

    由圖6可知,經(jīng)誘導(dǎo)的E.coliBL21(pET-eryKR1M)中表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶和陰性對照的相比,存在明顯的差異,重組菌在45.0~62.0 ku之間有明顯的突變的酮還原酶域表達(dá)條帶(相對分子量為57 ku,包括了pET-28a載體表達(dá)的His tag片段)。利用BandScan 5.0軟件分析目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE掃描圖片,其中E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的5.7%,與異源表達(dá)野生型eryKR1基因的E.coliBL21(pET-eryKR1)2中EryKR1酶域的表達(dá)量5.89%基本一致。

    2.4 E.coli BL21(pET-eryKR1M)催化還原4種羰基底物

    E.coliBL21(pET-eryKR1M)和E.coliBL21 (pET-eryKR1)2重組菌以環(huán)己酮、2-辛酮、4-氯乙酰乙酸乙酯和苯乙酮分別為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,以E.coliBL21(pET-28a)針對這些底物的轉(zhuǎn)化液作為陰性對照進(jìn)行氣相色譜檢測,結(jié)果見表1。野生型和突變型重組菌以環(huán)己酮為底物的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜見圖7。

    a.E.coli BL21(pET-eryKR1)2還原環(huán)己酮轉(zhuǎn)化液 b.E.coli BL21(pET-eryKR1M)還原環(huán)己酮轉(zhuǎn)化液

    表1 重組菌E.coli BL21(pET-eryKR1M)對4種底物的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測結(jié)果

    由表1和圖7可知,E.coliBL21 (pET-eryKR1M)重組菌不能還原環(huán)己酮,而野生型重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1)2卻可還原環(huán)己酮產(chǎn)生環(huán)己醇,產(chǎn)率可達(dá)93.24%,且兩種重組菌對其它底物幾乎沒有還原作用。這說明EryKR1酶域中α6和α7間的氨基酸定點(diǎn)突變之后,確實(shí)會(huì)影響酶域與底物環(huán)己酮的結(jié)合,使得酶域不能催化還原環(huán)己酮,但酶域也沒有因此突變,而改變對其它底物的催化特異性。

    利用Swiss-model對RHGVIEMP殘基替換成ActKR對應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸殘基EHYSDIWEVS的突變型EryKR1酶域的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,對比突變前后EryKR1的三維結(jié)構(gòu)(如圖8所示),發(fā)現(xiàn)EryKR1酶域中α6和α7之間的氨基酸突變后(圖8a),與野生型酶域(圖8b)相比,該區(qū)域伸出了空間之外,這樣一個(gè)突變,可能造成不同結(jié)構(gòu)的底物不能正常進(jìn)入到酶活性中心,進(jìn)而不能發(fā)生催化反應(yīng)。

    圖8 突變型EryKR1酶域與野生型EryKR1的空間結(jié)構(gòu)比對

    2.5 討論

    在細(xì)胞正常的新陳代謝活動(dòng)中,大多數(shù)的反應(yīng)如糖代謝、類固醇生物合成等,都能產(chǎn)生醛或酮中間產(chǎn)物。這些含酮和醛的化合物是很強(qiáng)的突變劑,在生物體中,存在很多酶可代謝這些中間產(chǎn)物,如短鏈脫氫酶/還原酶家族和醛酮還原酶超家族(Aldo-keto reductase,AKR)等,都可以將羰基還原成相應(yīng)醇[13]。短鏈脫氫酶/還原酶家族是氧化還原酶超家族之一,該家族大約有3000個(gè)成員,作用的底物廣泛,包括乙醇、糖、類固醇、芳香族化合物等。SDRs家族成員雖然一級序列只有15%~30%的同源性,但是三級結(jié)構(gòu)卻有著高度的相似性[14](除了羧基端有較大的差異),均形成典型的Rossman折疊,具有很多保守的氨基酸序列。放線菌素聚酮還原酶ActKR和糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的酮還原酶域均屬于SDR超家族[4,5]。

    2004年,Korman等和Hadfield等提出芳香族聚酮還原酶和其它SDR家族成員最大的差異是α6和α7間的10個(gè)氨基酸殘基,而這個(gè)區(qū)域?yàn)榈孜锝Y(jié)合口袋的一部分,是SDR家族中最不保守的區(qū)域,決定了SDR家族成員的不同的底物特異性[3,4]。本研究根據(jù)ActKR和EryKR1的氨基酸序列比對結(jié)果和預(yù)測的二維結(jié)構(gòu)比較結(jié)果,推測EryKR1酶域中的α6和α7之間的氨基酸序列RHGVIEMP也為底物結(jié)合口袋中的一部分,決定了該酶域的底物特異性。并利用重疊PCR技術(shù),將eryKR1基因中編碼該區(qū)域的堿基替換成編碼ActKR中對應(yīng)序列EHYSDIWEVS的相應(yīng)堿基,并構(gòu)建了異源表達(dá)該突變型eryKR1基因(即eryKR1M基因)的重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1M),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型重組菌株E.coliBL21(pET-eryKR1)2相比,突變型重組菌不能還原環(huán)己酮,且對于其它類型的羰基底物,也沒有因突變而產(chǎn)生還原能力,說明該區(qū)域的突變使得原來的底物環(huán)己酮不能進(jìn)入到酶的活性中心,且盡管替換成芳香族酮還原酶的對應(yīng)位點(diǎn),也不能因此使芳香族底物苯乙酮進(jìn)入到酶的活性中心,說明該區(qū)域雖然控制底物特異性,但仍需要和其它底物結(jié)合位點(diǎn)相互配合,才能使底物進(jìn)入酶的活性中心,進(jìn)而發(fā)生催化還原反應(yīng)。由此可見,如果想通過定點(diǎn)突變改變EryKR1的底物特異性,除了該區(qū)域的突變,可能還需要其它的底物結(jié)合位點(diǎn)的突變進(jìn)行配合。

    3 結(jié)論

    為驗(yàn)證糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶域EryKR1中的控制底物特異性位點(diǎn),以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板,用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出α6和α7之間的氨基酸殘基RHGVIEMP對應(yīng)的核苷酸序列被替換的EryKR1酶域DNA片段eryKR1M,并克隆到表達(dá)載體pET-28a上,構(gòu)建了質(zhì)粒pET-eryKR1M,轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliBL21(DE3)后,獲得了重組菌株E.coliBL21(pET-eryKR1M)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳分析表明重組大腸桿菌E.coliBL21(pET-eryKR1M)中的重組蛋白質(zhì)表達(dá)量占全菌胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的5.7%。E.coliBL21 (pET-eryKR1M)和異源表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的重組菌E.coliBL21 (pET-gdh1)進(jìn)行雙重組菌耦合,對4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和環(huán)己酮4種底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化還原,利用氣相色譜分析轉(zhuǎn)化液,結(jié)果顯示突變型的重組菌E.coliBL21(pET-eryKR1M)失去野生型重組菌E.coliBL21 (pET-eryKR1)2還原環(huán)己酮的能力,結(jié)合EryKR1酶域與放線菌素聚酮還原酶ActKR的氨基酸序列比對和二維結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果,推測α6和α7間氨基酸殘基RHGVIEMP為EryKR1酶域中的底物結(jié)合口袋組成單元,對酶活性保持非常重要。

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