α1腎上腺素受體亞型對(duì)脊髓損傷大鼠膀胱排空的調(diào)節(jié)作用

楊立民，李健夫

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科 錦州 121000

α1腎上腺素受體亞型對(duì)脊髓損傷大鼠膀胱排空的調(diào)節(jié)作用

楊立民，李健夫

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科 錦州 121000

脊髓損傷；腎上腺素受體；膀胱；大鼠

近年來(lái)，隨著車禍等意外事故的增加，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)發(fā)生率逐年升高，尤其對(duì)于年輕患者，提高損傷后的生活質(zhì)量成為目前亟待解決的問(wèn)題。SCI后，排尿中樞受到損害或中斷，從而導(dǎo)致尿潴留及排尿功能障礙[1]，其中膀胱的并發(fā)癥尤為困擾患者日常生活的難題。研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，α1腎上腺素受體亞型a、b和d在尿道和膀胱均有分布，并對(duì)調(diào)節(jié)膀胱排空起著重要的作用。作者觀察了α1腎上腺素受體亞型在大鼠SCI損傷模型膀胱組織中的表達(dá)變化，為用其治療SCI后尿潴留及排尿困難提供理論支持。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組及SCI模型的建立選取3個(gè)月齡成年健康SD雌性大鼠20只，體重240～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為SCI組與假手術(shù)組，每組10只。SCI組采用改良Allen’s打擊法建立T10節(jié)段SCI損傷模型[6]：水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒、鋪巾。以T10棘突為中心縱行切開(kāi)長(zhǎng)約2 cm，逐層分離至棘突顯露，切除T10椎板，顯露硬脊膜。將薄金屬片放在硬脊膜上，將質(zhì)量10 g的金屬物自20 mm高度自由落下，打擊金屬片，隨后立即移開(kāi)。以大鼠尾部出現(xiàn)卷曲、擺動(dòng)作為SCI造模成功標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)畢單籠單只喂養(yǎng)，SCI組膀胱區(qū)每天人工按壓排尿2次。假手術(shù)組僅切開(kāi)T10全椎板及T9、T11的部分椎板，不行打擊處理。

1.2標(biāo)本取材SCI組與假手術(shù)組大鼠飼養(yǎng)4周后處死，取出大鼠膀胱并稱重，收集的膀胱組織于-80 ℃凍存。

1.3α1腎上腺素受體亞型mRNA表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)取凍存的膀胱組織300 mg，液氮下磨成粉末，按照Trizol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)提取總RNA。紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)提取物濃度，A(260 nm)與A(280 nm)之比在1.8～2.0，符合要求。參照核苷酸排列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，以GAPDH作為內(nèi)參，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行相關(guān)引物的合成。PCR反應(yīng)體系：5×Buffer 5 μL，目的基因2.5 μL，上、下游引物各10 pmol oligd(dT)，4 μL dNTP(2.5 mmol/L)，RNA酶抑制劑 1 μL，5 μmol/L MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 U尿嘧啶-N-糖基化酶，2×SYBR Green PCR Master Mix，加入DEPC水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。分析溶解曲線并測(cè)量濃度值，mRNA表達(dá)水平采用Ct (2-ΔΔCt)值表示[7]。

表1 PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組大鼠膀胱質(zhì)量及膀胱組織中α1腎上腺素受體mRNA表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.5結(jié)果

1.5.1 2組大鼠造模4周后膀胱質(zhì)量比較 SCI組膀胱濕重[(0.816±0.037) g]較假手術(shù)組[(0.209±0.021) g]增加(t=42.814,P<0.001)。

1.5.2 2組大鼠膀胱組織中α1腎上腺素受體mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。大鼠SCI模型建立4周后，SCI組大鼠膀胱組織中α1a、α1b和α1d腎上腺素受體mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組下降，其中α1d腎上腺素受體mRNA表達(dá)水平下降比率較少。

表2 2組α1a、α1b及α1d腎上腺素受體mRNA表達(dá)水平的比較

2 討論

SCI后，部分患者可出現(xiàn)尿潴留甚至膀胱肥大癥狀，在某些脊髓橫斷的患者中，自主排尿由不協(xié)調(diào)的膀胱與尿道括約肌活動(dòng)代替[8]。而膀胱內(nèi)的持續(xù)高壓可損傷上尿道并導(dǎo)致膀胱肥大[9]。這給SCI患者的日常生活和護(hù)理帶來(lái)了很大的困難。目前關(guān)于SCI后膀胱頸與后尿道的相關(guān)病理生理學(xué)研究較多，而對(duì)膀胱本身的相關(guān)報(bào)道較少[2，10]。該研究結(jié)果顯示，大鼠SCI 4周后，膀胱質(zhì)量升高，表明大鼠SCI后膀胱內(nèi)的持續(xù)高壓導(dǎo)致了膀胱肥大。

以往研究[11]發(fā)現(xiàn)，α1腎上腺素受體各亞型在慢性出口梗阻的大鼠膀胱中表達(dá)水平不一，其中α1d表達(dá)升高，而α1a表達(dá)降低，提示α1d腎上腺素受體有望成為控制膀胱刺激癥狀的治療靶點(diǎn)[12]。目前臨床上常用選擇性α1d腎上腺素受體拮抗劑萘哌地爾和α1a腎上腺素受體拮抗劑西洛多辛治療下尿路癥狀。而萘哌地爾不僅可改善排尿癥狀，還可改善良性前列腺肥大所致的尿潴留癥狀。

有研究[13]報(bào)道，α1a、α1b和α1d腎上腺素受體屬于G蛋白家族，其可調(diào)節(jié)內(nèi)源性去甲腎上腺素和腎上腺素，從而導(dǎo)致機(jī)體器官的平滑肌收縮，提示在大鼠SCI后出現(xiàn)的一系列膀胱癥狀中，α1a、α1b和α1d腎上腺素受體也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

由于3種α1腎上腺素受體亞型具有極其相似的氨基酸序列，因此難以利用特異性強(qiáng)的抗體進(jìn)行免疫組化或Western blot檢測(cè)。熒光定量PCR作為檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法，可以敏感地檢測(cè)α1a、α1b和α1d腎上腺素受體mRNA在大鼠膀胱的表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠SCI 4周后，3種α1腎上腺素受體亞型mRNA在膀胱的表達(dá)均下降，其中α1d腎上腺素能受體mRNA的表達(dá)下降比率最小。α1d腎上腺素能受體與內(nèi)源性去甲腎上腺素和腎上腺素密切相關(guān)，這也提示其可作為一潛在的治療靶點(diǎn)，為SCI后存在排尿困難患者的治療帶來(lái)希望[12]。

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(2013-01-14 收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.038