冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

劉俊保，岳靜宇，唐引引

1)南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合科 南京 210029 2)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 3)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450000

冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

劉俊保1，2)△，岳靜宇3)，唐引引3)

1)南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合科 南京 210029 2)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 3)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450000

△男，1966年3月生，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)，E-mail：Liu-371@sohu.com

冬凌草甲素；食管鱗狀細(xì)胞癌；EC9706；增殖；凋亡

目的：觀察冬凌草甲素對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法用MTT法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并計(jì)算凋亡率；激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度冬凌草甲素作用后EC9706細(xì)胞中游離Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果MTT法顯示冬凌草甲素作用EC9706細(xì)胞株后，抑制率隨濃度增高而增高(F=370.600,P<0.001)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，冬凌草甲素作用EC9706細(xì)胞48 h后，G1/G0期細(xì)胞均顯著增多(F=24.200，P<0.001)；細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，冬凌草甲素均能明顯誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡(P<0.05)，冬凌草甲素40 μmol/L組的作用效果最佳(F=10.214、37.820，P<0.001)。不同濃度冬凌草甲素均升高了EC9706細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度(F=24.400，P<0.001)。結(jié)論冬凌草甲素可抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

食管癌是消化系統(tǒng)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年新增食管癌病例45萬(wàn)人，我國(guó)發(fā)病集中在中原太行山區(qū)及南方潮汕區(qū)[1]。食管癌5 a生存率只有20%左右[2]。中醫(yī)藥在抑制癌腫生長(zhǎng)、降低腫瘤臨床分期、延長(zhǎng)生存期、提高生存質(zhì)量等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。冬凌草甲素是我國(guó)自行研制的一種從中藥冬凌草中提取的有效成分，它是從唇形香茶屬植物冬凌草中提取的一種以貝殼杉烯為骨架的四環(huán)二萜類化合物。該研究通過(guò)觀察冬凌草甲素體外誘導(dǎo)人食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞凋亡的情況，探討其作用機(jī)制，為食管癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑冬凌草甲素購(gòu)自鄭州博興生物技術(shù)公司，純度98%。胰蛋白酶消化液、四甲基偶氮唑鹽、DMEM購(gòu)自北京Solarbio公司，無(wú)支原體新生牛血清購(gòu)自杭州天杭生物科技有限公司，細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。無(wú)鈣臺(tái)氏液(NaCl 4.0 g、KCl 0.1 g、NaHCO30.5 g、Na2HPO4·12H2O 0.07 g、MgCl2·6H2O 0.105 g、葡萄糖0.5 g加400 mL超純水?dāng)嚢枞芙?，調(diào)pH值為7.4，定容至500 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組EC9706細(xì)胞由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%無(wú)支原體新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于95%相對(duì)濕度、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，隔天換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按50 000 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))和不同終濃度的冬凌草甲素組(用含冬凌草甲素終濃度分別為10、20和40 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng))。

1.3各組細(xì)胞增殖的檢測(cè)將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，按1.2分組處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白調(diào)零組。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后，棄去舊液，每孔加入180 μL RPMI 1640和20 μL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，取出后棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，搖床上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔OD值，按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=(空白對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/空白對(duì)照組OD值×100%[3]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4各組細(xì)胞周期和凋亡的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶5 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去瓶?jī)?nèi)舊液，按1.2分組處理，分別培養(yǎng)48、72 h后，棄去瓶?jī)?nèi)舊液，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次(離心1 000 r/min，5 min/次)，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，按照細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟操作，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5各組細(xì)胞胞漿中游離鈣離子([Ca2+]i)的激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)將鈣熒光探針Fluo-3/AM(美國(guó)AAT公司)用DMSO配成5 mmol/L液體，促溶劑F-127(美國(guó)AAT公司)溶于DMSO，配成200 g/L的液體；分別將上述兩液體加入到12.5 mL RPMI 1640液中，-20 ℃避光保存?zhèn)溆?。?xì)胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，用無(wú)鈣臺(tái)氏液洗滌3次，每次1 mL，取200 μL Fluo-3/AM與F-127混合液，正對(duì)微型皿的中央圓形凹槽加入，37 ℃避光孵育30 min，吸去負(fù)載液，用無(wú)鈣臺(tái)氏液洗滌3次，于凹槽中加入200 μL無(wú)鈣臺(tái)氏液，于激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)Meri-dian公司)上檢測(cè)[Ca2+]i。將負(fù)載好熒光探針的細(xì)胞置于載物臺(tái)上，調(diào)焦距使圖像達(dá)到最清晰，選取外形較規(guī)整的細(xì)胞進(jìn)行觀察。先用氬離子激光慢速預(yù)掃描，調(diào)至視野清晰后正式掃描。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終保持掃描參數(shù)一致。參照文獻(xiàn)[4]，每組選取6～8個(gè)視野，每個(gè)視野選取5個(gè)細(xì)胞。利用激光共聚焦顯微鏡所配備的計(jì)算與圖像軟件(FV10-ASW 1.6 Viewer)計(jì)算熒光強(qiáng)度(fluorecence intensity，F(xiàn)I)平均值，F(xiàn)I越大，[Ca2+]i越高。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞胞漿中[Ca2+]i的影響，應(yīng)用4×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同培養(yǎng)時(shí)間各組冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞早、晚期凋亡的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響冬凌草甲素組在加藥后24 h，倒置顯微鏡下觀察(圖1)，可見(jiàn)大部分細(xì)胞由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞間接觸松散，細(xì)胞匯合率低，出現(xiàn)部分漂浮細(xì)胞，部分細(xì)胞膜皺縮發(fā)泡，少量細(xì)胞固縮呈圓形或卵圓形且透亮，個(gè)別細(xì)胞變小。10、20和40 μmol/L的冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制率分別為(19.45±2.34)%、(41.38±3.32)%和(78.83±4.99)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=370.600，P<0.001)。

2.2不同濃度冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞周期和凋亡的影響見(jiàn)表1、2。

2.3各組細(xì)胞胞漿中[Ca2+]i的檢測(cè)結(jié)果藥物作用2 h后，空白對(duì)照組FI為553.83±133.67，10、20和40 μmol/L冬凌草甲素組的FI分別為2 090.241±296.24、2 354.60±511.78和2 680.22±276.59，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.400，P<0.001)。用藥組細(xì)胞FI明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明不同濃度冬凌草甲素作用后EC9706細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯上升。

圖1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響(×200)

表1冬凌草甲素作用48h后對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響 %

組別nG1/G0SG2/M空白對(duì)照組351．62±0．4137．86±0．6110．76±0．76冬凌草甲素10μmol/L組361．77±4．19?#32．73±2．21#5．51±3．04冬凌草甲素20μmol/L組361．90±2．93?#32．21±1．34#5．89±1．99#冬凌草甲素40μmol/L組371．40±3．65?24．16±1．49?4．44±1．48?F24．20023．090111．200P<0．001<0．001<0．001

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與冬凌草甲素40 μmol/L組比較，P<0.05。

表2 冬凌草甲素對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與冬凌草甲素40 μmol/L組比較，P<0.05。

3 討論

目前，食管癌病因不明，癌變的分子機(jī)制不清，治療以手術(shù)、放療、化療、生物治療為主，缺乏有效的預(yù)防措施和特異性的診治指標(biāo)與方法，因而發(fā)病率和病死率仍未得到有效控制。中醫(yī)藥毒副作用較小，單用中藥或聯(lián)合放、化療等，在改善吞咽困難、減輕癌痛、提高免疫能力、縮小瘤體、改善全身狀況、減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、提高生存質(zhì)量和5 a生存率方面療效確切，并且可為放、化療減毒增效。冬凌草甲素抑制細(xì)胞增殖與阻滯細(xì)胞周期有關(guān)[5]。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10～40 μmol/L冬凌草甲素對(duì)于體外培養(yǎng)的EC9706細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，且其促進(jìn)凋亡的能力具有濃度的依賴性，這與冬凌草甲素誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞的凋亡結(jié)論一致[6]。流式細(xì)胞檢測(cè)儀的細(xì)胞周期結(jié)果證明不同濃度冬凌草甲素均能夠使EC9706細(xì)胞阻滯于G1或G2/M期，從而使食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，其機(jī)制可能為冬凌草甲素參與調(diào)控胞膜鈣通道的運(yùn)輸系統(tǒng)或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路等。有研究[6]表明：冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞凋亡早期，線粒體出現(xiàn)形態(tài)改變，如線粒體增生、腫脹等。冬凌草能抑制DNA、RNA的合成，其作用靶點(diǎn)是DNA聚合酶[7]；其發(fā)揮抗腫瘤活性的作用機(jī)制可能是作用于凋亡可控因素，如降低bcl-2的表達(dá)水平，激活Caspase途徑等誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]；端粒酶與細(xì)胞凋亡密切相關(guān), 還可以增加對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬[9]，并影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)[10]。

總之，冬凌草甲素作為我國(guó)自行研制的中藥抗癌單體，在細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤的作用，且在臨床上試用于食管癌、胃癌等治療顯示出較好的結(jié)果，值得今后作進(jìn)一步深入的研究。

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(2013-05-11 收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

Influence of oridonin on EC9706 cell proliferation and apoptosis

LIUJunbao1，2),YUEJingyu3),TANGYinyin3)

1)SubjectofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,theFirstClinicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029 2)DepartmentofTraditionalChineseMedicine,thePeople’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 3)StateKeyLaboratory,theFirstTeachingHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

oridonin; esophageal squamous cell carcinoma; EC9706; proliferation;apoptosis

Aim: To study the influence of oridonin on esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cell proliferation and apoptosis in vitro. Methods: MTT assay was used to detect the inhibition effect of oridonin on the growth of EC9706; flow cytometry was applied to detect the impact of oridonin on cell cycle and apoptosis of EC9706, and calculated the apoptosis rate of cells; change of Ca2+fluorescence intensity of EC9706 affected by different concentrations of oridonin was observed by laser scanning confocal microscope. Results: MTT assay showed that the inhibition rate in the experiment group increased with the rising of concentration(F=370.600,P<0.001) after oridonin acting on EC9706; results of cell cycle detected by flow cytometry showed that the number of cell in G0and G1stage increased notably after oridonin acting on EC9706 for 48 hour respectively(F=24.200，P<0.001); results of apoptosis showed that oridonin could obviously induce the apoptosis of EC9706(P<0.05), and the effect was the best when the oridonin concentration was 40 μmol/L(F=10.214，37.820，P<0.001). Different concentrations of oridonin could increase Ca2+fluorescence intensity of EC9706, and the difference was significant (F=24.400，P<0.001). Conclusion: oridonin can improve the inhibition effects on proliferation and apoptosis of EC9706 cell.

*河南省衛(wèi)生廳5451項(xiàng)目 2011077

R735.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.003