濁點(diǎn)萃取反萃取—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用測(cè)定金線蓮中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留

劉洪波+趙曉芳+石貴英+邵清松+李明焱

[摘要] 建立濁點(diǎn)萃取反萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定金線蓮中甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯和氰戊菊酯5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法。選用聚乙二醇6000作為濁點(diǎn)萃取的提取劑、異辛烷為反萃取劑，氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果表明，5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在15～2 000 μg·kg^-1呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.955～0.999，加標(biāo)回收率85.12%～101.6%，RSD 3.1%～8.4%，檢出限0.63～3.10 μg·kg^-1，定量限2.10～10.31 μg·kg^-1。該方法操作簡(jiǎn)單、安全，可應(yīng)用于金線蓮中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 金線蓮；濁點(diǎn)萃取；反萃??；氣質(zhì)聯(lián)用；菊酯類農(nóng)藥；殘留分析

[收稿日期] 2013-11-27

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303167）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13H280010）；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究（分析測(cè)試）項(xiàng)目（2013C37099）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014C32017）

[通信作者] 邵清松，博士，副教授，主要從事藥用植物栽培與育種研究，E-mail：sqszjfc@126.com

[作者簡(jiǎn)介] 劉洪波，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物農(nóng)藥、林木病蟲害防治，E-mail：lhb@zafu.edu.cn

金線蓮Anoectochilus roxburghii又名金線蘭、金絲草，為蘭科開唇蘭屬多年生名貴中藥材，主產(chǎn)于福建、浙江、臺(tái)灣、江西、貴州等地，具有清熱涼血、除濕解毒等功效，用于治療糖尿病、腎炎、急慢性肝炎等癥，在民間享有“藥王”的美稱。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于金線蓮的種苗繁育、規(guī)范化栽培、化學(xué)成分、藥理作用的研究較多。由于市場(chǎng)需求量增加，金線蓮栽培面積不斷擴(kuò)大，紅蜘蛛、蚜蟲、小地老虎等蟲害逐漸增加，種植戶主要采用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行防治，從而產(chǎn)生了一些農(nóng)藥殘留問題[1-3]。

濁點(diǎn)萃取法（cloud point extraction，簡(jiǎn)稱CPE）是近年來發(fā)展較快的環(huán)保型樣品前處理方法之一，是將表面活性劑應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域的一種重要而實(shí)用的技術(shù)，也稱為膠束介質(zhì)萃取法。它是利用表面活性劑水溶液的增溶和分相行為而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)富集的分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取方法相比， 具有高效、低毒、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)， 目前已成功應(yīng)用于金屬離子、蛋白質(zhì)、環(huán)境等樣品的前處理和分離、純化[4-10]。在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的分析中，最常用的分析方法是GC-ECD，GC-FID[11-13]。本研究采用濁點(diǎn)萃取反萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法，對(duì)金線蓮中的甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯和氰戊菊酯5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留量測(cè)定進(jìn)行探索，為金線蓮規(guī)范化栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 5975C-7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；KQ-300E超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；FRESCO17高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）。

甲氰菊酯fenpropathrin（99.4%，迪馬公司）、高效氯氟氰菊酯lambda-cyhalothrin（99%，阿拉丁公司）、氯菊酯permethrin（99.5%，迪馬公司）、氯氰菊酯cypermethrin（99%，阿拉丁公司）、氰戊菊酯fenvalerate（99%，迪馬公司）；乙腈（色譜純，天津四友）；聚乙二醇6000（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；異辛烷（色譜純，阿拉丁公司）；硫酸銨（化學(xué)純，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司），超純水。

1.2 儀器條件 色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（0.25 μm×250 μm×30 m）；載氣為高純氦氣（>99.999%）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱升溫程序：起始溫度90 ℃，恒溫1 min后以每分鐘30 ℃升溫至230 ℃，恒溫1 min后以每分鐘2 ℃升溫至280 ℃；進(jìn)樣方式不分流；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：連接處溫度280 ℃；EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)；溶劑延遲5.5 min；譜庫NIST08；其他質(zhì)譜條件見表1。

1.3 濁點(diǎn)萃取-反萃取 稱取1.0 g已粉碎的金線蓮干樣于20 mL刻度試管中，加入1.5 g硫酸銨和5.0 mL 8% 乙腈水溶液，充分混勻后置于超聲波清洗器中超聲1 h，過濾后用2.0 mL 8%乙腈水溶液沖洗殘?jiān)?，沖洗3次，合并濾液并置于離心管中，依次加入0.9 mL 20%聚乙二醇6000水溶液和4.5 g硫酸銨，用8%乙腈水溶液定容至15 mL，使聚乙二醇6000、乙腈和硫酸銨的最終濃度分別為1.2%，8%，40%，然后置于30 ℃水浴中保持30 min，最后以3 500 r·min^-1離心10 min，用長(zhǎng)細(xì)針頭的注射器吸出下部水相后留下表面活性劑富集相（<0.5 mL）。用超純水把表面活性劑富集相稀釋至0.5 mL，加入0.2 mL異辛烷，超聲25 min后，取上層異辛烷相1 μL進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)[14-20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇 考察了不同的程序升溫條件下5種農(nóng)藥的分離情況。結(jié)果表明采用1.2中的程序升溫條件時(shí)，5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液、添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液的金線蓮樣品中的農(nóng)藥都能較好地分離，見圖1。

2.2 濁點(diǎn)萃取-反萃取條件的選擇 比較了用表面活性劑聚乙二醇6000（鹽硫酸銨、溶劑乙腈萃取，異辛烷反萃取）、聚乙二醇4000（鹽硫酸鈉、溶劑正丁醇萃取，正己烷反萃?。┖蚑riton X-100（鹽氯化鈉、溶劑丙酮萃取，正己烷反萃?。?duì)農(nóng)藥回收率的影響[12-13，18]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表面活性劑聚乙二醇6000濁點(diǎn)溫度較低，30 ℃左右就可以，而聚乙二醇4000，Triton X-100要50 ℃以上，且用Triton X-100分相不明顯、回收率較低，最后采用1.3中的濁點(diǎn)萃取-反萃取方法。endprint

2.3 線性關(guān)系、檢出限、定量限和線性范圍 取不同濃度（10～2 000 μg·kg^-1）的5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2中的檢測(cè)條件進(jìn)樣，確定它們的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），具體見表2。從表2可以看出該方法的各項(xiàng)指標(biāo)基本能夠滿足5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)的要求，表明該方法是可行的。

2.4 回收率與精密度 在1.00 g的金線蓮干樣中分別添加3種濃度50，100，500 μg·kg^-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，充分混勻，按照1.3中的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定農(nóng)藥回收率，同一個(gè)樣重復(fù)測(cè)定5次（n=5），見表3。從表3可以看出5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的平均回收率在85.12%～101.6%，RSD在 3.1%～8.4%。

2.5 樣品分析 按以上的方法測(cè)定了市售的5個(gè)金線蓮樣品中的菊酯類農(nóng)藥殘留。其中樣品1、樣品2、樣品3、樣品4中均未檢出，樣品5中檢出含有甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯，分別為12.23，20.51 μg·kg^-1。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了濁點(diǎn)萃取反萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定金線蓮中甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯和氰戊菊酯5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法。本方法操作簡(jiǎn)單、安全，能基本滿足金線蓮中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的實(shí)際檢測(cè)。濁點(diǎn)萃取反萃取作為一種新的萃取濃縮手段，已經(jīng)成功在諸多領(lǐng)域替代傳統(tǒng)的液-液萃取，用于不同樣品中具有不同極性的有機(jī)化合物的萃取和濃縮，且整個(gè)采樣過程融于一步簡(jiǎn)單的操作中，與傳統(tǒng)的方法相比，在安全低毒、耗時(shí)短、操作方便等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。與氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）的聯(lián)用改變了濁點(diǎn)萃取技術(shù)主要集中于高效液相色譜（HPLC）方面的狀況，拓寬了濁點(diǎn)萃取技術(shù)的應(yīng)用范圍。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 羅曉青，吳明開，查蘭松，等. 貴州藥用植物野生金線蓮資源調(diào)查[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24（2）：826.

[2] Shao Qing-song， Wang Hong-zhen， Guo Hai-peng， et al. Effects of shade treatments on photosynthetic characteristics， chloroplast ultrastructure， and physiology of Anoectochilus roxburghii[J]. PLoS ONE， 2014， 9（2）： 85996.

[3] 邵清松，周愛存，黃瑜秋，等. 不同移栽條件對(duì)金線蓮組培苗成活率及生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（6）：955.

[4] 馬立利，秦冬梅，簡(jiǎn)秋，等. 濁點(diǎn)萃取法在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（2）：159.

[5] 陳建波，王云飛，奚道珍. 濁點(diǎn)萃取技術(shù)及其在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[J].農(nóng)藥，2011，50（7）：479.

[6] Valfredo A L， Moacy S S， Graciete T D， et al. Development of a cloud-point extraction method for copper and nickel determination in food samples[J]. J Hazard Mater， 2008，159（2）： 245.

[7] Edson L S， Paulod S R. Simultaneous flow injection preconcentration of lead and cadmium using cloud point extraction and determination by atomic absorption spectrometry[J]. J Hazard Mater， 2009， 161（1）： 142.

[8] Pourreza N， Zareian M. Determination of orange Ⅱ in food samples after cloud point extraction using mixed micelles[J]. J Hazard Mater， 2009， 165（1）： 1124.

[9] Liu Wei， Zhao Wei-jun， Chen Jian-bo， et al. A cloud point extraction approach using Triton X-100 for the separation and preconcentration of Sudan dyes in chilli powder[J]. Anal Chim Acta， 2007， 605（1）： 41.

[10] Evangelos K， Dimosthenis L， Miltiades I， et al. Micelle-mediated separation and cloud-point extraction[J]. Trends Anal Chem， 2005， 24（5）： 426.

[11] 楊蕾，王保興，侯英，等. SBSE-TDS-GC-MS 快速測(cè)定茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：435.

[12] 莫小榮，鄭春慧，陳建偉，等. 濁點(diǎn)萃取-異辛烷反萃取-氣相色譜測(cè)定茶葉中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué)，2009，37（8）：1178.

[13] 張舒婷，陳曉輝，于治國(guó)，等. 濁點(diǎn)萃取-氣相色譜法測(cè)定槲寄生中20種農(nóng)藥殘留[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（20）：2577.endprint

[14] 蘇建峰， 陳晶， 陳競(jìng)秀，等. 混合食品中19種菊酯類農(nóng)藥殘留的極性區(qū)間排列凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（7）：686.

[15] 吳勝芳， 王利平， 劉楊岷，等. 加速溶劑萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定菊花中的3種菊酯類農(nóng)藥殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（11）：65.

[16] 薛平， 杜利君， 林勤保，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定乳制品中17種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留方法的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（9）：948.

[17] 崔淑華，郭慶龍，張峰，等.氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定花生及制品中17 種菊酯類農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué)，2013，41（6）：944.

[18] 周璐， 陳敏， 張凱，等.濁點(diǎn)萃取-正己烷反萃取氣相色譜法測(cè)定蘋果汁中5種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（ 4）： 492.

[19] Ariel R Fontana， Mara F Silva， Luis D Martnez， et al. Determination of polybrominated diphenyl ethers in water and soil samples by cloud point extraction-ultrasound-assisted back-extract ion-gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A， 2009， 1216：4339 .

[20] Pang G F， Cao Y Z， Zhang J L， et al. Validation study on 660 pesticide residues in animal tissues by gel perm eation chromatography cleanup /gas chromatography-mass spectrometry and liquid chrom atography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A， 2006， 1125（1）： 1.

Determination of five pyrethroid pesticides residues in Anoectochilus

roxburghii by cloud point extraction-back extraction and GC-MS

LIU Hong-bo， ZHAO Xiao-fang， SHI Gui-ying， SHAO Qing-song， LI Ming-yan

（1.Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China；

2. Rare Herbal Medicine and Engineering Institute of Zhejiang Province， Wuyi 321200， China）

[Abstract] A method for residual determination of 5 pyrethroid pesticides in Anoectochilus roxburghii by cloud point extraction-back extraction-GC-MS was established. PEG 6000 was used as extraction agent and isooctane was used for back-extractant. The content was calculated by external standard method. The linear range was from 15 to 2 000 μg·kg^-1with the good correlation coefficients （0.955-0.999）. The recoveries at spiked concentrations of 50-500 μg·kg^-1ranged from 85.12% to 101.6%. The limit of detection and quantification of 5 pyrethroid pesticides were in the range of 0.63-3.10 μg·kg^-1and 2.10-10.31 μg·kg^-1， respectively. The proposed method can be applied to the determination of pyrethroid pesticides residues in A. roxburghii.

[Key words] Anoectochilus roxburghii； cloud point extraction； back-extraction； gas chromatography-mass spectrometry； pyrethroid pesticides； residual determination

doi：10.4268/cjcmm20141513

[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint