基于鑭離子增敏效應的四環(huán)素殘留檢測方法

賀江　楊戀　楊品紅

摘要：依據(jù)稀土離子La3+能夠增強四環(huán)素紫外吸收強度的原理，建立一種四環(huán)素殘留快速檢測方法。水產品中的四環(huán)素殘留用EDTA-McIlvaine緩沖液提取，提取液用HLB固相萃取小柱凈化；甲醇洗脫液氮吹濃縮至干后的殘渣用1 mL 混合溶液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl緩沖溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，搖勻，于室溫下靜止反應30 min，最后將樣液置于微量比色皿中在390 nm處測定吸光度，并換算出抗生素殘留濃度。結果表明，所建立的方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度，可在水產養(yǎng)殖地或超市等現(xiàn)場推廣應用。

關鍵詞：稀土元素；紫外吸收；四環(huán)素；抗生素殘留；快速測定；水產品

中圖分類號： TS201.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0299-02

收稿日期：2013-10-25

基金項目：湖南省教育廳科研項目（編號：12C0828）；湖南文理學院博士啟動項目（2011）；湖南文理學院生命科學學院省級平臺開放項目（編號：SKYPT201202）。

作者簡介：賀江（1983—），男，江西萍鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事食品安全與食品生物技術研究。E-mail：hejiang1119@163.com。水產養(yǎng)殖業(yè)近年來在我國發(fā)展迅速，但抗生素殘留問題是影響水產養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一[1]。建立有效的殘留檢測技術體系是對抗生素殘留問題進行有效控制的前提與基礎。現(xiàn)有的抗生素殘留檢測方法主要有2類：一類是基于HPLC等精密儀器的標準檢測方法[2-3]，但這類方法所用的儀器設備價格昂貴，也不便于現(xiàn)場操作；另一類是基于微生物抑制[4-5]或酶聯(lián)免疫反應[6]的簡便方法，但是微生物抑制法耗時較長，酶聯(lián)免疫檢測法的關鍵試劑（抗體）制備較困難。因此，建立簡便有效的抗生素殘留檢測方法成為一項被廣泛關注且具有較大現(xiàn)實意義和應用價值的研究工作[7]。因此，本研究選取水產養(yǎng)殖中較常用的四環(huán)素為對象，依據(jù)稀土元素能夠增強四環(huán)素紫外吸收強度的原理[8]，結合對魚肉組織樣品前處理方案的探討，建立一種簡便有效、可在現(xiàn)場進行操作的四環(huán)素殘留檢測方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮的鯽魚（經(jīng)標準檢測方法測定無四環(huán)素殘留），購自湖南省常德市某農貿市場；四環(huán)素標準品，購自德國Dr公司；99% La2O3，購自江西省贛州市科明銳有色金屬材料有限公司；色譜甲醇，購自默克公司；其他試劑均為分析純；試驗用水均為超純水。

1.2儀器與設備

UV-1750紫外-可見分光光度儀（日本島津公司），TDL-40B 低速離心機，MTN-2800D氮吹儀，勻漿機，HLB固相萃取小柱，微型比色皿，其他常規(guī)玻璃器皿。

1.3方法

1.3.1主要試劑的配制

1.3.1.1四環(huán)素標準母液精確稱取2 mg四環(huán)素，加水完全溶解，定容至100 mL，配制成20 μg/mL四環(huán)素母液，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2EDTA-McIlvaine緩沖溶液稱取一定量的Na2EDTA、Na2HPO4 和檸檬酸，分別配制成0.1、0.2、0.4 mol/L的溶液。按照3 ∶2的體積比混合Na2HPO4和檸檬酸，配制成McIlvaine緩沖液。將0.1 mol/L EDTA溶液與McIlvaine緩沖液按照1 ∶1的體積比混合，配制成EDTA-McIlvaine緩沖溶液（混合后pH值約為4）。

1.3.1.3La3+溶液稱取0.163 g La2O3，溶于少量濃HCl中，小心蒸發(fā)近干，加水定容至100 mL，配制成 10 mmol/L 儲備液，保存于冰箱，使用時稀釋至1 mmol/L。

1.3.1.4Tris-HCl緩沖溶液將50 mL 0.1 mol/L Tris溶液和38.5 mL 0.1 mol/L HCl溶液混合，定容至 100 mL，此時pH值約為7.6。

1.3.2稀土離子La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響取2份 1 mL四環(huán)素母液分別加入到25 mL容量瓶中，其中一份依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，再加水定容；另一份則加入2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，再加水定容；室溫靜置30 min后，在200～450 nm波長范圍內進行光譜掃描。

1.3.3四環(huán)素濃度與紫外吸收強度的線性相關性取不同量的四環(huán)素母液于25 mL容量瓶中，再依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，最后加水定容，使體系中四環(huán)素濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、20、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。室溫靜置30 min后測定紫外吸光度，并分析四環(huán)素濃度與紫外吸光度的相關性。

1.3.4魚肉組織中四環(huán)素殘留檢測過程

1.3.4.1稱樣提取將新鮮的鯽魚洗凈，去鱗去皮，除去內臟，剔除魚骨，將魚肉置于勻漿機內打碎、拌勻，除去絞不碎的物質。稱取5.00 g魚肉組織于15 mL塑料離心管中，加入 4 mL EDTA-McIlvaine緩沖液均質提取，3 000 r/min離心 5 min，取上清液；魚肉組織繼續(xù)用緩沖液提取2次，每次提取 3 mL，并將3次提取液合并。

1.3.4.2凈化濃縮將提取液以1滴/s的速度通過預先經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化的HLB固相萃取小柱，待上清液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL 甲醇與水的混合液（體積比為5 ∶95）淋洗；棄去全部流出液，用10 mL甲醇洗脫，并收集洗脫液于潔凈干燥的離心管中；最后將洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至干。

1.3.4.3溶解測定于上述離心管中加入1 mL 混合液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl緩沖溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，搖勻，于室溫下靜置反應30 min，測定其吸光度。endprint

1.3.5檢測方法的靈敏度、準確度和精確度評價

1.3.5.1靈敏度評價將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進行處理和吸光度測定，并計算相對標準差，以吸光度為3倍標準差時所對應的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進行處理和測定，并計算加標回收率。

1.3.5.3精確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進行處理和計算，并計算變異系數(shù)。

2結果與分析

2.1稀土離子La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對照試驗分析了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個弱的吸收帶，當它與稀土離子反應形成絡合物后，在配位場的作用下，在吸光度增加的同時，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測方法的建立，“平臺”狀峰型有利于提高檢測的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強度的線性相關性

在確定了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎上，試驗進一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內變化時，待測物濃度與吸光度之間的相關性，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對數(shù)據(jù)作進一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測；經(jīng)計算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測定效果

實際樣品中的殘留檢測效果除了與最終的測定方法相關外，還與樣品的前處理方法密切相關。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進行吸光度測定，將四環(huán)素殘留濃度與相應吸光度進行回歸分析，結果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關性，說明可以利用該方法進行四環(huán)素殘留檢測。

2.4檢測方法的靈敏度、準確度和精密度評價

按照上述方法，對5份空白魚肉組織進行測定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標準差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測方法的最低檢測限為0.095 μg/g。對3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進行測

定，測得回收率在80%～110%之間，說明該檢測方法的準確性良好。對添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進行測定，其添加回收率穩(wěn)定，相對標準差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結論與討論

利用紫外-可見分光光度法進行定量分析具有操作簡便的特點，但是其檢測靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測的要求。本研究從檢測方法本身和配套前處理方案2個方面考慮，以提高檢測效果。在檢測方法上，通過在檢測體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進而提高檢測靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對提取液進行凈化以消除基質干擾，提高檢測穩(wěn)定性；利用空白基質液配置標準物質進而制作標準曲線，以提高檢測的準確性；對提取液進行濃縮（配合使用微量比色皿）進一步提高檢測的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國相關法規(guī)規(guī)定的水產品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

參考文獻：

[1]朱崗，高會平. 介紹一種新型水產環(huán)保型抗菌素——中魚尼考[J]. 中國水產，2002（10）：85.

[2]袁冬梅，李一婧. 養(yǎng)殖水產品中四環(huán)素類抗生素殘留的高效液相色譜測定法[J]. 食品工業(yè)科技，2008（1）：281，285.

[3]朱世超，錢卓真，吳成業(yè). 水產品中7種大環(huán)內酯類抗生素殘留量的HPLC-MS/MS測定法[J]. 南方水產科學，2012，8（1）：54-60.

[4]黃曉蓉，鄭晶，吳謙，等. 食品中多種抗生素殘留的微生物篩檢方法研究[J]. 食品科學，2007，28（8）：418-421.

[5]陳樹橋，周國勤，陳桂芳，等. 水產品中抗生素藥物殘留檢測平板的制備研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2006（3）：177-179.

[6]劉智宏，葉妮，郭文林，等. 四環(huán)素類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法[J]. 中國農業(yè)科學，2009，42（1）：318-323.

[7]葉興乾，劉東紅，陳健初. 牛奶抗生素殘留快速檢測技術進展及應用現(xiàn)狀[J]. 農業(yè)工程學報，2005，21（4）：181-185.

[8]江虹，劉紹璞，胡小莉，等. 稀土與四環(huán)素類抗生素絡合物的光度法研究[J]. 分析化學，2003，31（10）：1207-1211.

[9]動物性食品中獸藥最高殘留限量[J]. 中國豬業(yè)，2010（8）：10-12.endprint

1.3.5檢測方法的靈敏度、準確度和精確度評價

1.3.5.1靈敏度評價將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進行處理和吸光度測定，并計算相對標準差，以吸光度為3倍標準差時所對應的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進行處理和測定，并計算加標回收率。

1.3.5.3精確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進行處理和計算，并計算變異系數(shù)。

2結果與分析

2.1稀土離子La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對照試驗分析了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個弱的吸收帶，當它與稀土離子反應形成絡合物后，在配位場的作用下，在吸光度增加的同時，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測方法的建立，“平臺”狀峰型有利于提高檢測的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強度的線性相關性

在確定了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎上，試驗進一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內變化時，待測物濃度與吸光度之間的相關性，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對數(shù)據(jù)作進一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測；經(jīng)計算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測定效果

實際樣品中的殘留檢測效果除了與最終的測定方法相關外，還與樣品的前處理方法密切相關。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進行吸光度測定，將四環(huán)素殘留濃度與相應吸光度進行回歸分析，結果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關性，說明可以利用該方法進行四環(huán)素殘留檢測。

2.4檢測方法的靈敏度、準確度和精密度評價

按照上述方法，對5份空白魚肉組織進行測定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標準差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測方法的最低檢測限為0.095 μg/g。對3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進行測

定，測得回收率在80%～110%之間，說明該檢測方法的準確性良好。對添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進行測定，其添加回收率穩(wěn)定，相對標準差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結論與討論

利用紫外-可見分光光度法進行定量分析具有操作簡便的特點，但是其檢測靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測的要求。本研究從檢測方法本身和配套前處理方案2個方面考慮，以提高檢測效果。在檢測方法上，通過在檢測體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進而提高檢測靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對提取液進行凈化以消除基質干擾，提高檢測穩(wěn)定性；利用空白基質液配置標準物質進而制作標準曲線，以提高檢測的準確性；對提取液進行濃縮（配合使用微量比色皿）進一步提高檢測的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國相關法規(guī)規(guī)定的水產品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

參考文獻：

[1]朱崗，高會平. 介紹一種新型水產環(huán)保型抗菌素——中魚尼考[J]. 中國水產，2002（10）：85.

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[3]朱世超，錢卓真，吳成業(yè). 水產品中7種大環(huán)內酯類抗生素殘留量的HPLC-MS/MS測定法[J]. 南方水產科學，2012，8（1）：54-60.

[4]黃曉蓉，鄭晶，吳謙，等. 食品中多種抗生素殘留的微生物篩檢方法研究[J]. 食品科學，2007，28（8）：418-421.

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[6]劉智宏，葉妮，郭文林，等. 四環(huán)素類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法[J]. 中國農業(yè)科學，2009，42（1）：318-323.

[7]葉興乾，劉東紅，陳健初. 牛奶抗生素殘留快速檢測技術進展及應用現(xiàn)狀[J]. 農業(yè)工程學報，2005，21（4）：181-185.

[8]江虹，劉紹璞，胡小莉，等. 稀土與四環(huán)素類抗生素絡合物的光度法研究[J]. 分析化學，2003，31（10）：1207-1211.

[9]動物性食品中獸藥最高殘留限量[J]. 中國豬業(yè)，2010（8）：10-12.endprint

1.3.5檢測方法的靈敏度、準確度和精確度評價

1.3.5.1靈敏度評價將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進行處理和吸光度測定，并計算相對標準差，以吸光度為3倍標準差時所對應的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進行處理和測定，并計算加標回收率。

1.3.5.3精確度評價取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標準液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進行處理和計算，并計算變異系數(shù)。

2結果與分析

2.1稀土離子La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對照試驗分析了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個弱的吸收帶，當它與稀土離子反應形成絡合物后，在配位場的作用下，在吸光度增加的同時，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測方法的建立，“平臺”狀峰型有利于提高檢測的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強度的線性相關性

在確定了La3+對四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎上，試驗進一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內變化時，待測物濃度與吸光度之間的相關性，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對數(shù)據(jù)作進一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測；經(jīng)計算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測定效果

實際樣品中的殘留檢測效果除了與最終的測定方法相關外，還與樣品的前處理方法密切相關。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進行吸光度測定，將四環(huán)素殘留濃度與相應吸光度進行回歸分析，結果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關性，說明可以利用該方法進行四環(huán)素殘留檢測。

2.4檢測方法的靈敏度、準確度和精密度評價

按照上述方法，對5份空白魚肉組織進行測定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標準差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測方法的最低檢測限為0.095 μg/g。對3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進行測

定，測得回收率在80%～110%之間，說明該檢測方法的準確性良好。對添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進行測定，其添加回收率穩(wěn)定，相對標準差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結論與討論

利用紫外-可見分光光度法進行定量分析具有操作簡便的特點，但是其檢測靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測的要求。本研究從檢測方法本身和配套前處理方案2個方面考慮，以提高檢測效果。在檢測方法上，通過在檢測體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進而提高檢測靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對提取液進行凈化以消除基質干擾，提高檢測穩(wěn)定性；利用空白基質液配置標準物質進而制作標準曲線，以提高檢測的準確性；對提取液進行濃縮（配合使用微量比色皿）進一步提高檢測的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國相關法規(guī)規(guī)定的水產品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

參考文獻：

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