胎盤(pán)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶rs4818、rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系

賴寶玲，王晨虹，周璐，王勤，蘇衛(wèi)蘭

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院 產(chǎn)科，廣東 深圳 518028)

胎盤(pán)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶rs4818、rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系

賴寶玲，王晨虹，周璐，王勤，蘇衛(wèi)蘭

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院 產(chǎn)科，廣東 深圳 518028)

目的探討胎盤(pán)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因rs4818、rs4633位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法便利抽樣法選擇2011年3月至2012年8月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的孕婦217例，其中子癇前期孕婦92例為子癇前期組，健康孕婦125例為對(duì)照組。收集兩組孕婦產(chǎn)后胎盤(pán)組織，提取胎盤(pán)DNA，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)平臺(tái)及MassARRAY-IPLEX技術(shù)對(duì)COMT基因 rs4818及rs4633位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),分析其基因型及等位基因分布情況。結(jié)果胎盤(pán)組織COMT基因rs4818位點(diǎn)基因型GG、GC、CC的基因型頻率和G、C等位基因頻率在子癇前期組與對(duì)照組之間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組胎盤(pán)COMT基因 rs4633位點(diǎn)CC、CT、TT三種基因型頻率和C、T等位基因頻率在子癇前期組與對(duì)照組之間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論胎盤(pán)COMT rs4818、rs4633單核苷酸多態(tài)性與子癇前期發(fā)生無(wú)關(guān)。

子癇前期；兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶；基因多態(tài)性;胎盤(pán)

[Nurs J Chin PLA,2014，31(9)：30-32,42]

子癇前期發(fā)病率較高，是引起圍產(chǎn)期孕婦及新生兒發(fā)病的重要原因[1]。盡管研究多年，其病因和發(fā)病機(jī)制仍未明確。但胎盤(pán)被公認(rèn)是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2]發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因缺失的孕鼠出現(xiàn)子癇前期樣臨床及病理改變，如早產(chǎn)、血壓升高、尿蛋白升高等；胎盤(pán)出現(xiàn)類似人類蛻膜血管病變，且出現(xiàn)腎小球血管內(nèi)皮病變。由此提出胎盤(pán)COMT低表達(dá)可能是子癇前期發(fā)病的啟動(dòng)因素。前期研究[3-4]顯示，患重度子癇前期的漢族產(chǎn)婦胎盤(pán)COMT表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而COMT是兒茶酚胺和雌激素代謝過(guò)程的重要酶。研究[5]表明，編碼COMT的基因具有遺傳多態(tài)性，而其常見(jiàn)的rs4818、rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性與基因表達(dá)、酶活性有關(guān)。因此，其編碼基因的多態(tài)性可能與子癇前期發(fā)生有關(guān)。目前，有關(guān)胎盤(pán)COMT基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)檢測(cè)胎盤(pán)組織COMT rs4818和rs4633兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性，進(jìn)一步探討與子癇前期相關(guān)的胎盤(pán)COMT低表達(dá)的上游原因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 便利抽樣法選取2011年3月至2012年8月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的孕婦217例，其中子癇前期孕婦92例為子癇前期組，健康孕婦125例為對(duì)照組，收集兩組孕婦產(chǎn)后胎盤(pán)組織。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂(lè)杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)，即孕20周后首次出現(xiàn)至少間隔6 h的2次血壓≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且24 h尿蛋白定量≥300 mg。兩組孕婦均為中國(guó)漢族婦女、單胎無(wú)畸形。兩組孕婦年齡、產(chǎn)次分布均衡，且無(wú)慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病病史。所有孕婦產(chǎn)前均簽署知情同意書(shū)，并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 胎盤(pán)娩出10 min內(nèi)，從胎盤(pán)母體面中央無(wú)菌剪取約0．5 cm×0．5 cm×0.5 cm的胎盤(pán)絨毛組織(避開(kāi)出血、壞死及鈣化區(qū)域)1塊，用磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Hyclone公司)反復(fù)漂洗，干紗布吸除水分，裝入無(wú)菌無(wú)RNA/DNA酶凍存管-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 基因檢測(cè) 應(yīng)用MALDI-TOF-MS平臺(tái)及MassARRAY-IPLEX技術(shù)檢測(cè)COMT rs4818及rs4633位點(diǎn)基因型。TRIzol(Invitrogen公司)提取胎盤(pán)組織總DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和濃度。引物設(shè)計(jì)：采用Sequenom公司AssayDesigner軟件包設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(見(jiàn)表1，引物設(shè)計(jì)合成均由深圳華大基因公司完成)。將DNA樣本稀釋到5 ng/μL，使用Ex Taq聚合酶，在384孔板常規(guī)擴(kuò)增待測(cè)片段(PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15 s；94℃變性20 s、56℃退火30 s、72℃延伸1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min)，然后在PCR產(chǎn)物中加入2 μL堿性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase ，SAP)反應(yīng)液，去除未反應(yīng)完的dNTP(反應(yīng)程序：37℃40 min、85℃5 min)，然后根據(jù)SEQUENOM程序進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)。所得反應(yīng)產(chǎn)物加入6 mg樹(shù)脂脫鹽，混合后補(bǔ)充16 μL去離子水。用納升點(diǎn)樣儀將產(chǎn)物分點(diǎn)在質(zhì)譜微陣列芯片上。

表1 COMT基因兩個(gè)位點(diǎn)SNP檢測(cè)的引物

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦胎盤(pán)COMT基因 rs4818和rs4633位點(diǎn)的基因型的Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測(cè) 子癇前期組和對(duì)照組胎盤(pán)COMT rs4818位點(diǎn)和rs4633位點(diǎn)的頻率分布經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(子癇前期組rs4818位點(diǎn)：χ2=2.566 ,P=0.11;rs4633位點(diǎn)：χ2=2.464，P=0.12；對(duì)照組rs4818位點(diǎn)：χ2=3.277，P=0.07；rs4633位點(diǎn)：χ2=2.724，P=0.10)，表明本研究所選的樣本代表性好。

2.2 兩組胎盤(pán)COMT基因 rs4818位點(diǎn)基因型及等位基因頻數(shù)分布 見(jiàn)表2。兩組胎盤(pán)COMT基因 GG 、GC、和CC基因型頻數(shù)分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；G、C等位基因頻數(shù)分布差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組胎盤(pán)COMT基因 rs4818位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布[n(%)]

2.3 兩組胎盤(pán)COMT基因 rs4633位點(diǎn)基因型及等位基因頻數(shù)分布 見(jiàn)表3。兩組胎盤(pán)COMT基因 CC 、CT、 TT各基因型頻數(shù)分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且等位基因C、T在病例組和對(duì)照組頻數(shù)分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 兩組胎盤(pán)COMT 基因rs4633位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布[n(%)]

3 討論

本研究應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)中國(guó)漢族產(chǎn)婦胎盤(pán)COMT基因 rs4818和rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性，分析其與子癇前期發(fā)生的關(guān)系。本病例對(duì)照研究未發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)COMT rs4818和rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性與子癇前期的相關(guān)性。

COMT是廣泛存在于人體內(nèi)的一種代謝酶，是兒茶酚胺和雌激素代謝的關(guān)鍵酶。編碼COMT基因位于22號(hào)染色體1區(qū)2亞帶，包含6個(gè)外顯子[5]。前期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期組胎盤(pán)COMT mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，但導(dǎo)致其低表達(dá)的上游機(jī)制不詳。研究[5]發(fā)現(xiàn)，COMT活性主要由遺傳因素決定，而COMT活性降低可導(dǎo)致兒茶酚雌激素代謝減慢，致使兒茶酚雌激素積聚，進(jìn)而易發(fā)生多種疾病。較多資料[6-7]表明，COMT的基因多態(tài)性在不同種族和個(gè)體間的差異與精神疾病、慢性疼痛、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥、絕經(jīng)時(shí)間等有關(guān)。因此，認(rèn)為COMT基因突變可能導(dǎo)致酶活性下降、兒茶酚胺滅活減少，二-甲氧雌二醇(2-ME)合成減少，可能增加子癇前期的危險(xiǎn)[8]。COMT具有多個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性，rs4680、rs4818、rs6269和rs4633是研究最廣泛的位點(diǎn)。不同種族人群研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，COMT基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病可能相關(guān)，然而對(duì)胎盤(pán)的相關(guān)研究缺乏。而胎盤(pán)是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵所在，因此研究胎盤(pán)COMT基因多態(tài)性更有助于揭示子癇前期病因。目前，檢測(cè)胎盤(pán)COMT基因多態(tài)性與子癇前期關(guān)系的研究?jī)H見(jiàn)一篇[12]，該研究檢測(cè)72名正常產(chǎn)婦與13名子癇前期產(chǎn)婦胎盤(pán)COMT基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)COMT rs4818位點(diǎn)基因多態(tài)性AA基因型明顯增加子癇前期患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究進(jìn)行胎盤(pán)COMT兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)兩組基因rs4818、rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性具明顯差異，說(shuō)明COMT rs4818、rs4633位點(diǎn)基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)生無(wú)相關(guān)性。然而子癇前期是一個(gè)多因素參與、多階段發(fā)展的復(fù)雜病變，很可能是由多基因決定和受多種環(huán)境因素影響的疾病[13-15]。而且COMT的基因型頻率及等位基因頻率分布在不同種族、群體、個(gè)體間存在差異[16-17]，加之抽樣本身存在的偏差和樣本量的大小都會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響，單個(gè)SNP改變對(duì)疾病的影響較小，下一步加大樣本量進(jìn)行多個(gè)SNP聯(lián)合檢測(cè)并進(jìn)行單體型分析，有助于深入研究子癇前期病因與COMT的關(guān)系。

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(本文編輯：郁曉路)

AssociationbetweenPolymorphismsofPlacentalCatechol-o-methyltransferaseGeners4818、rs4633andPreeclampsia

Lai Baoling，Wang Chenhong，Zhou Lu，Wang Qin ，Su Weilan

Corresponding(Department of Obstetrics，Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital affiliated to South Medical University，Shenzhen 518028, Guangdong Province,China)

Corresponding author: Wang Chenhong，E-mail: noralibrary@163.com

ObjectiveTo investigate whether polymorphisms of placental COMT gene are associated with preeclampsia，and to explore the role of COMT in the pathogenesis of preeclampsia.MethodsBy convenience sampling，217 patients were randomly selected including 92 patients with preeclampsia and 125 normal pregnant women.Placental tissue were collected and to extract DNA.Placental COMT (rs4818 and rs4633) polymorphisms were genotyped by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) and MassARRAY-IPLEX.ResultsThere were no significant differences in placental COMT rs4818 GG，GC,CC genotypes frequencies and G，C allele frequencies and between patients with preeclampsia and control group (P>0.05).There were no significant difference between two groups of the placenta COMT rs4818locus CC，CT，TT in patients with preeclampsia and control group(P>0.05).ConclusionPlacental COMT rs4818 and rs4633 genotypes have no association with preeclampsia.

preeclampsia；catechol-o-methyltransferase (COMT)；gene polymorphism

2013-06-27

2014-02-10

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)資助項(xiàng)目(180)

賴寶玲，博士，主要從事圍生期醫(yī)學(xué)研究

王晨虹，E-mail：noralibrary@163.com

10.3969/j.issn.1008-9993.2014.09.009

R473.71

A

1008-9993(2014)09-0030-04