先天性巨結腸腸壁組織中L1CAM的表達

曹振杰，杜俊鵬，楊嬋嬋，孫雪花，黃 華，谷雅川，陳 琦#

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052 2)鄭州市中心醫(yī)院外科 鄭州 450007

先天性巨結腸腸壁組織中L1CAM的表達

曹振杰1)，杜俊鵬1)，楊嬋嬋2)，孫雪花1)，黃 華1)，谷雅川1)，陳 琦1)#

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052 2)鄭州市中心醫(yī)院外科 鄭州 450007

#通訊作者，男，1963年4月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：小兒消化道畸形，E-mail：chen63qi@126.com

先天性巨結腸；L1CAM

目的：探討先天性巨結腸(HD)腸壁組織中L1CAM的表達情況，從而分析L1CAM與HD的關系。方法利用免疫組化SP法和RT-PCR法檢測48例HD患兒狹窄段和擴張段腸壁組織以及46例正常結腸腸壁組織中L1CAM蛋白和mRNA的表達。結果HD狹窄段腸壁組織中L1CAM蛋白表達量為(13.147 0±0.519 8)，低于HD擴張段及正常結腸腸壁組織的(16.961 8±0.905 4)、(17.908 3±0.740 6)(t配對/t=27.697、25.346，P均<0.001)。HD狹窄段腸壁組織中L1CAM mRNA表達量為(4.316 4±0.387 0)，低于HD擴張段及正常結腸腸壁組織的(5.717 8±0.486 0)、(6.344 3±0.236 6)(t配對/t=19.661、14.237，P均<0.001)。狹窄段腸壁組織中L1CAM蛋白和mRNA的表達呈正相關(r=0.968，P<0.001)。結論L1CAM蛋白和mRNA的異常低表達可能參與了HD的發(fā)生過程。

先天性巨結腸(Hirschsprung disease，HD)是兒科多發(fā)病之一，發(fā)病率居先天性消化道畸形第2位，占存活嬰兒的1/5 000～1/2 000[1]。HD主要的病理變化是患兒在胚胎發(fā)育過程中神經嵴細胞遷移障礙，腸神經發(fā)育出現(xiàn)停頓，腸壁肌間神經叢的神經節(jié)細胞缺失，以致受累腸段異常收縮，其近端結腸代償性擴張與肥厚而形成巨結腸。無神經節(jié)細胞腸段內肌間及黏膜下神經叢神經節(jié)細胞的缺失是由于胚胎早期發(fā)育停頓所致[2-3]。HD的病因尚不完全清楚，目前對于HD的研究主要集中在病因遺傳學。國外近來相繼報道[4-5]X染色體連鎖腦積水患兒同時患有HD者占至少3%，并且發(fā)現(xiàn)這些患兒的L1CAM基因存在突變，因此推測L1CAM和HD的發(fā)病關系密切。該研究旨在探討L1CAM蛋白在散發(fā)性HD腸壁組織中能否正常表達，并應用一步法RT-PCR方法半定量分析其mRNA的表達情況，從而探討L1CAM與HD的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2004年11月至2005年3月鄭州大學第三附屬醫(yī)院收治的經鋇灌腸、直腸黏膜活檢和術后病理檢查證實為散發(fā)性的HD患兒48例，男29例，女19例，年齡14 d～13 歲。每例患兒均收集HD狹窄段(無神經節(jié)細胞段)和擴張段(有神經節(jié)細胞段)腸壁組織標本。收集同期在鄭州大學第三附屬醫(yī)院行結腸套疊腸切除吻合術、剖腹探查腸造瘺術術中切除的正常結腸腸壁組織46例作為對照，患兒男27例，女19例，年齡14 d～12歲，均未發(fā)現(xiàn)合并HD，且均無HD家族史。

1.2主要試劑兔抗人L1CAM單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；總RNA提取試劑Trizol、RT-PCR相關試劑盒均購自大連寶生物公司，引物合成也由該公司完成。

1.3L1CAM蛋白的免疫組化檢測所有腸壁組織經40 g/L中性多聚甲醛固定，石蠟包埋組織3 μm厚連續(xù)切片，脫蠟水化；體積分數為3% H2O2室溫5～10 min以滅活內源性過氧化物酶；95 ℃加熱10 min修復抗原；滴加體積分數為0.5%正常羊血清室溫下封閉30 min；棄去羊血清，滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，再加二抗，37 ℃ 40 min，PBS洗滌2次后滴加辣根酶標記鏈霉卵白素(1:200)，37 ℃ 40 min；自來水中止反應，DAB顯色，蘇木素輕度復染，常規(guī)脫水后封片。以試劑盒提供的已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。L1CAM蛋白陽性染色為細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用日本JVC-F30B 3-CCD彩色攝像儀錄入L1CAM免疫組化染色結果，并以此進行真彩色圖像分析處理，采用德國Kontron Elektronik公司KONTRON IBAS 2.5全自動圖像分析系統(tǒng)測定免疫組化圖片灰度值，取5個200倍視野下灰度值的平均值作為該標本的測定值。

1.4L1CAMmRNA表達的RT-PCR檢測所取標本置于經DEPC水處理過的凍存管中，置于-80 ℃冰箱中備用。用Trizol試劑盒一步法提取腸壁組織總RNA，并用紫外分光光度計測總RNA濃度。 L1CAM上游引物為5’-GGGAAAGATGGTCGTG GCGCTC-3’,下游引物為5’-TGTAGTCTGAGTGGTT GTCGGAGGTGA-3’,產物大小608 bp；內參β-actin上游引物為5’-GTGGGCATGGGTCAGAAG-3’,下游引物為5’-GAGGCGTACAGGGATAGCA-3’，產物大小302 bp。取總RNA 20 μL，按操作說明書逆轉錄，取逆轉錄產物2 μL,加入20.5 μL反應體系。反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個循環(huán)。取擴增產物5 μL加樣，75 g/L聚丙稀酰胺凝膠電泳，拍照，計算機掃描，由于目的基因表達較弱，故計算(L1CAM灰度值×10)/β-actin灰度值比值，即為目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1L1CAM蛋白在不同腸壁組織中的表達見圖1、表1。

圖1 L1CAM蛋白在HD狹窄段(A)、擴張段(B)以及正常結腸(C)腸壁組織中的表達(SP，×200)

表1 L1CAM蛋白和mRNA在不同腸壁組織中的表達

L1CAM蛋白：HD狹窄段腸壁組織與HD擴張段腸壁組織比較，t配對=27.697，P<0.001；HD狹窄段腸壁組織與正常結腸腸壁組織比較，t=25.346，P<0.001；HD擴張段腸壁組織與正常結腸腸壁組織比較，t=0.894，P=0.374。L1CAM mRNA：HD狹窄段腸壁組織與HD擴張段腸壁組織比較，t配對=19.661，P<0.001；HD狹窄段腸壁組織與正常結腸腸壁組織比較，t=14.237，P<0.001；HD擴張段腸壁組織與正常結腸腸壁組織比較，t=0.640，P=0.524。

2.2L1CAMmRNA在不同腸壁組織中的表達見圖2、表1。

2.3HD狹窄段腸壁組織中L1CAM蛋白和mRNA表達的相關性HD狹窄段腸壁組織中L1CAM蛋白與mRNA的表達呈正相關(r=0.968，P<0.001)。

圖2 L1CAM mRNA在不同腸壁組織中的表達

M：Marker；k1～k3：擴張段腸壁組織；x1～x3：狹窄段腸壁組織；Z：正常結腸腸壁組織。

3 討論

HD是一種以腸道末端神經節(jié)細胞完全缺如為特征的常見消化道發(fā)育畸形，發(fā)病率極高，男女比例為4:1，大多數為散發(fā)性。HD發(fā)病過程中導致神經節(jié)細胞缺如的原因說法不一。在胚胎形成過程中，黏膜下層的神經節(jié)細胞是由肌間的神經母細胞移行過去的，在此過程中任何原因造成神經發(fā)育停頓，則使停頓的遠端腸段缺乏神經節(jié)細胞，即可致HD[6-8]。L1CAM是CAM家族重要成員，人類L1CAM基因定位于Xq28處，長4 860 bp，其編碼的蛋白與神經元的黏附、識別及遷移關系密切。近年來的研究[9-10]表明，L1CAM在腸道正常神經發(fā)育及功能發(fā)揮中通過以下途徑起作用：L1CAM通過參與神經細胞生長的信號轉導途徑影響神經節(jié)細胞的頭尾向遷移、分化；與RET基因相互作用，維持正常神經系統(tǒng)功能的發(fā)揮；通過與神經生長因子信號通路相互作用，調節(jié)神經生長發(fā)育。這提示一旦L1CAM mRNA或蛋白發(fā)生異常，極可能引起腸道神經發(fā)育異常，造成HD。

該組患兒臨床資料顯示，男性發(fā)病率高于女性，這可能與L1CAM位于Xq28，而X染色體在男女體內不對稱分布有關。該研究結果還顯示：L1CAM mRNA和蛋白在正常結腸腸壁組織中表達穩(wěn)定、均一，在HD擴張段腸壁組織中L1CAM mRNA和蛋白的表達也未見明顯增加，而HD狹窄段腸壁組織中L1CAM mRNA和蛋白表達明顯下降，低于HD擴張段和正常結腸腸壁組織。這種HD狹窄段L1CAM mRNA和蛋白表達下降而HD擴張段表達正常的現(xiàn)象可能與機體自身存在的因子表達反饋過度有關。作者還發(fā)現(xiàn)，L1CAM蛋白和mRNA在HD狹窄段腸壁組織中的表達有關。綜上所述，作者認為，HD的發(fā)生可能與L1CAM的低表達有關，而且L1CAM蛋白的低表達可能是其mRNA的異常低表達有關。

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(2013-07-28收稿 責任編輯姜春霞)

Expression of L1CAM in intestinal wall tissues of Hirschsprung disease

CAOZhenjie1),DUJunpeng1),YANGChanchan2),SUNXuehua1),HUANGHua1),GUYachuan1),CHENQi1)

1)DepartmentofPediatrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)DepartmentofSurgery,theCentralHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450007

Hirschsprung disease; L1CAM

Aim: To investigate the expression of L1CAM in intestinal wall tissues of Hirschsprung disease(HD), and to analyze the relationship between L1CAM and HD. Methods: SP method and RT-PCR were used to detected the protein and mRNA expression of L1CAM in the stenotic and ectatic intestinal wall tissues of 48 patients with HD and 46 cases of normal colon intestinal wall tissues. Results: The protein expression of L1CAM in the stenotic intestinal wall tissues of HD was (13.147 0±0.519 8),which was lower than those of the ectatic intestinal wall tissues of HD (16.961 8±0.905 4) and the normal colon intestinal wall tissues (17.908 3±0.740 6) (tpaired/t=27.697, 25.346,P<0.001). The mRNA expression of L1CAM in the stenotic intestinal wall tissues of HD was (4.316 4±0.387 0),which was lower than those of the ectatic intestinal wall tissues of HD (5.717 8±0.486 0) and the normal colon intestinal wall tissues (6.344 3±0.236 6) (tpaired/t=19.661, 14.237,P<0.001). The protein and mRNA expression of L1CAM in the stenotic intestinal wall tissues of HD had the positive relationship(r=0.968,P<0.001). Conclusion: Abnormal low expression of L1CAM mRNA and protein in the stenotic intestinal wall tissues may be involved in the pathogenesis of HD.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.032

R726.5