T細(xì)胞亞群在原發(fā)性干燥綜合征患者外周血中的表達(dá)水平及其意義

張 虹,范宏濤,和 芳,馬 莎,晉 松

(云南省第一人民醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,云南 昆明,650000)

干燥綜合征(SS)是一種自身免疫性疾病，主要侵犯唾液腺、淚腺等外分泌腺，病理表現(xiàn)主要是外分泌腺的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血清中可檢出多種自身抗體，當(dāng)該病不伴有其他自身免疫性疾病時(shí)，被稱為原發(fā)性干燥綜合征(PSS)[1]。大量研究[2-3]表明,PSS患者外周血的T細(xì)胞各亞群的表達(dá)水平與健康人群存在差異，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)在維持自身免疫耐受、抑制致病性免疫細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)照了32例PSS患者及35例健康人的外周血T細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果，嘗試探討T細(xì)胞亞群表達(dá)水平在PSS發(fā)病過(guò)程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2010年1月—2013年12月初次診斷為PSS的患者32例，其中男17例，女15例，年齡32～40歲，平均年齡(41.25±2.19)歲。另隨機(jī)選取本院健康體檢者35例，男18例，女17例，年齡30～41歲，平均年齡(42.08±3.17)歲。2組患者在年齡、性別等一般資料方面無(wú)顯著差異(P>0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：以2012年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)干燥綜合征分類標(biāo)準(zhǔn)[4]為依據(jù)，滿足口腔癥狀、眼部癥狀、眼部體征、組織學(xué)檢查、唾液腺受損及自身抗體等診斷條件。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 患有腫瘤者; ② 同時(shí)患有其他自身免疫性疾病者; ③ 有近期感染史者。

1.2 試劑與儀器

采用EPICS XL流式細(xì)胞儀，雙標(biāo)記單克隆抗體CD3/CD16+CD56-PE,CD4-FITC,CD25-PE,三標(biāo)記單克隆抗體CD3-PC5/D4-FITC/CD8-PE，以上儀器及試劑均購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司。

1.3 檢測(cè)方法

晨起抽取2組患者靜脈血，設(shè)置試驗(yàn)試管及陰性對(duì)照試管后，分別加入肝素抗凝血50 μL,再加入CD4-FITC和CD25-PE各10 μL,在對(duì)照試管中加入IgGl-FITC和IgG2a-PE各10 μL,室溫放置20 min,分別加入溶血?jiǎng)?50 μL,室溫避光放置15 min后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)250 μL,再放置15 min后，采用PBS洗滌2次，加PBS 500 μL之后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

比較2組CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、CD3+CD4-CD8-及CD4+CD25+high表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2組患者的CD3+、CD3+CD4-CD8+水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，觀察組的CD4+/CD8+、CD3+CD4+CD8-亞群的比例較觀察組有明顯升高(P<0.01),CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞與 CD4+CD25+high亞群的比例較觀察組顯著下降(P<0.01),見(jiàn)表1，圖1、圖2。

表1 2組患者的T細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較 %

圖1 1例健康人外周血CD4+CD25+high的表達(dá)

3 討 論

圖2 1例PSS患者外周血CD4+CD25+high的表達(dá)

SS是一種自身免疫性炎癥性疾病，其主要特點(diǎn)是外分泌腺中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、破壞，以及血清中存在多種自身抗體，該病在中國(guó)的發(fā)病率為0.29%～0.77%，女性為多，發(fā)病年齡大多在40～60歲，其中PSS的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。

目前研究[1]認(rèn)為,PSS的發(fā)病與環(huán)境因素、唾液腺上皮細(xì)胞破壞、T淋巴細(xì)胞及其亞群的時(shí)常，以及B淋巴細(xì)胞的過(guò)度反應(yīng)等有關(guān)。近年來(lái),T細(xì)胞亞群的變化與PSS發(fā)病之間的關(guān)系成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)外有研究[5-6]表明,PSS的發(fā)病可能與T細(xì)胞亞群的異常變化有關(guān)，免疫病理檢查發(fā)現(xiàn)，患者的外分泌腺中浸潤(rùn)的主要是T細(xì)胞，這些細(xì)胞的異常會(huì)導(dǎo)致外分泌腺導(dǎo)管以及上皮細(xì)胞的退化、萎縮和破壞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)口干、眼干等相關(guān)癥狀[7]。

自從1995年Sakaguchi等首次報(bào)道了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以來(lái)，這一類T細(xì)胞亞群與PSS發(fā)病之間的關(guān)系受到了廣泛關(guān)注。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能，它特異性地表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄因子FoxP3,可以通過(guò)IL-10等細(xì)胞因子發(fā)揮其抗炎和維持自身免疫耐受狀態(tài)的作用[8]。朱建東等[9]對(duì)比60例PSS患者及30例正常人的外周靜脈血發(fā)現(xiàn)，前者的血清IL-10水平顯著低于后者,IL-17水平則顯著高于后者，而IL-10主要由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌，發(fā)揮免疫抑制的作用，這一結(jié)果提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及功能下降，導(dǎo)致分泌的抑制性細(xì)胞因子減少，抑制能力出現(xiàn)相應(yīng)的下降，導(dǎo)致激活的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增多，這一系列過(guò)程可能參與了PSS的發(fā)病過(guò)程。覃羽華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在PSS患者中，其外周血的CD4+/CD8+比例顯著高于正常人，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則顯著降低，提示PSS患者存在明顯的致病性CD4+升高，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的降低則使得機(jī)體免疫耐受狀態(tài)遭到破壞。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有兩個(gè)來(lái)源，即胸腺和外周，但外周來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的具體分化機(jī)制目前還不清晰，依據(jù)其功能推測(cè)，當(dāng)人體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少時(shí)，人體對(duì)自身抗原的敏感性會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，這時(shí)人體就更易發(fā)生自身免疫類疾病。值得關(guān)注的是，有多項(xiàng)研究表明,CD25低表達(dá)的細(xì)胞可能并不具有調(diào)節(jié)功能，而只有CD25高表達(dá)的細(xì)胞才是真正的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，即CD4+CD25+high亞群細(xì)胞才具有調(diào)節(jié)作用[11-12]。鄭紅霞等[13]采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了25例PSS患者外周血的CD4+CD25+highT細(xì)胞水平，與20例正常人進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSS患者的CD4+CD25+highT細(xì)胞所占的比例顯著低于正常人，并且與病情活動(dòng)相關(guān)性指標(biāo)，如C反應(yīng)蛋白、IgG等呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，提示CD4+CD25+highT細(xì)胞與PSS的發(fā)病具有一定關(guān)系，且與病情的活動(dòng)性相關(guān)。此外，李冬梅等[14]研究表明，CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞在體外激活后，可產(chǎn)生IL-4、IL-19等細(xì)胞因子，或者與靶細(xì)胞直接接觸，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡，提示CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞具有自身免疫負(fù)調(diào)控的作用。因此，本研究在檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平時(shí)，選取了具有代表性的CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞及CD4+CD25+high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為檢測(cè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，2組人員的CD3+及CD3+CD4-CD8+的百分比無(wú)顯著差異，提示這兩個(gè)亞群可能沒(méi)有參與PSS的發(fā)病過(guò)程，而PSS患者CD4+/CD8+、CD3+CD4+CD8-亞群的表達(dá)水平較觀察組有明顯升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，該結(jié)果表明有致病性的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，而CD4+/CD8+比值的升高，一方面有利于機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性疾病的抗體，一方面也提示了機(jī)體自身的免疫調(diào)節(jié)功能處于紊亂狀態(tài)，同時(shí)，自身抗體的產(chǎn)生可能會(huì)引發(fā)唾液腺和淚腺的腺泡、腺體的損傷。本研究結(jié)果還表明,PSS患者的CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞及CD4+CD25+high亞群細(xì)胞的表達(dá)水平較正常人顯著下降，其對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用也隨之降低，從而使機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病的可能性增加，也與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，T細(xì)胞亞群的異常變化在PSS患者的發(fā)病過(guò)程中可能起到一定作用，尤其是CD4+CD25+high亞群的降低，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自身免疫抑制作用的下降，更加容易發(fā)生PSS。但本研究的臨床樣本偏小，有待增加樣本量，進(jìn)一步觀察研究。

[1]姚宏亮,朱可建.原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J].國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志,2013,39(5): 283.

[2]Komigama Y,Nakae S,Matsuki T,et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006,177(1): 566.

[3]Zhang F N,Wu J,Zhang W,et al.Immunology mechanism of CD4+CD25+T cell[J].J Nanjing Medical University,2004,18: 178.

[4]Shiboski S C,Shiboski C H,Criswell L A,et al.American College of Rheumatology Classification Criteria for Sj?gren′s Syndrome: A Data-Driven,Expert Consensus Approach in the Sj?gren′s International Collaborative Clinical Alliance Cohort[J].Arthritis Care & Research (Hoboken),2012,64: 475.

[5]Manel T,Bredberg A,Jacobsson L T,et al.CD4+T lymphocytopenia-a frequent finding in anti-SSA antibody serupositive patients with primary Sjogren's syndrome[J].J Rheumatol,2004,31(4): 726.

[6]Gottenberg J E,Lavie F,Abbed K,et al.CD4+CD25high regulatory T cells are not impaired in patients with primary Sj?gren′s syndrome[J].J Autoimmun,2005,24(3): 235.

[7]Yamamoto K.Pathogenesisi of Sj?gren′s syndrome.Autoimmun Rev,2003,2(1): 13.

[8]Komigama Y,Nakae S,Matsuki T,et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006,177(1): 566.

[9]朱建東,王忠泉,張品南.干燥綜合征患者Th17與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫失衡的觀察[J].放射免疫學(xué)雜志,2012,25(3): 301.

[10]覃羽華,岑光旅,韋葉生,等.原發(fā)性干燥綜合征患者T細(xì)胞亞群及CD4+CD25+T細(xì)胞檢測(cè)的意義[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,32(5): 665.

[11]Rangachari M,Mauermann N,Marty R R,et al.T-bet negatively regulates autoimmune myoearditis by suppressing local production of interleukin 17[J].J Exp Med 2006,2009,19: 203.

[12]Jacques-Eric G,Frederic L,Karim A,et al.CD4+CD25+highregulatory T cell are not impaired in patients with primary Sj?gren′s syndrome[J].J autoimmunity,2005,24: 235.

[13]鄭紅霞,于健寧,陶筱娟,等.原發(fā)性干燥綜合征患者外周血CD4+CD25+high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及意義[J].浙江實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,15(1): 3.

[14]李冬梅,厲小梅,李向培,等.原發(fā)性干燥綜合征患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/-T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(4): 482.