人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系

趙志明 郝桂敏 周亮 朱序理 王躍

·論著·

人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系

趙志明 郝桂敏 周亮 朱序理 王躍

目的探討體外受精-胚胎移植中人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)與相應(yīng)卵巢反應(yīng)性的關(guān)系。方法收集行體外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黃素化顆粒細(xì)胞28例，根據(jù)卵泡數(shù)不同進(jìn)行卵巢反應(yīng)性分組分為低反應(yīng)組、中反應(yīng)組和高反應(yīng)組；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)；RT-PCR測(cè)定顆粒細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)。分析人黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系。結(jié)果分離提純的人黃素化顆粒細(xì)胞于24 h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)良好。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，隨著獲卵數(shù)的增加bcl-2蛋白HSCORE評(píng)分(以下簡(jiǎn)稱HSCbcl-2)逐漸上升，HSCbcl-2與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(P<0.01)。高反應(yīng)組、中反應(yīng)組和低反應(yīng)組HSCbcl-2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，bcl-2 mRNA表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)。高反應(yīng)組、中反應(yīng)組和低反應(yīng)組bcl-2 mRNA表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論凋亡相關(guān)基因bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性有明顯的相關(guān)性。

體外受精；卵巢反應(yīng)性；顆粒細(xì)胞；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因

卵巢顆粒細(xì)胞合成和分泌雌激素和孕激素，有高度分裂增殖的潛能。在卵泡發(fā)育的不同階段，顆粒細(xì)胞增殖速度不同，當(dāng)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟并接近卵泡壁時(shí)，顆粒細(xì)胞分裂能力最強(qiáng)，對(duì)卵泡的形成和發(fā)育起重要作用[1]。體外受精(in vitro fertilization,IVF)中獲取的顆粒細(xì)胞，來自于成熟卵泡，即黃素化顆粒細(xì)胞，其功能狀態(tài)反映了此時(shí)顆粒細(xì)胞的功能[2]。本研究通過測(cè)定IVF中獲取的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2,bc1-2) mRNA及蛋白表達(dá)，比較bcl-2表達(dá)的變化，力圖探索它們對(duì)卵巢反應(yīng)性的影響，探討與凋亡相關(guān)基因bcl-2與卵巢生殖功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞標(biāo)本，取于2007年11月到2008年2月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF治療的不孕癥患者28例，月經(jīng)周期正常，不孕原因?yàn)殡p側(cè)輸卵管梗阻或男性不育。年齡23～37歲，平均(31±5)歲，基礎(chǔ)體溫呈雙向型，血清泌乳素水平在正常范圍，受試前3個(gè)月內(nèi)均未服用過激素類藥物。促排卵方案采用長(zhǎng)周期降調(diào)節(jié)方案，常規(guī)促性腺激素(gonadotrophin,Gn)刺激卵泡發(fā)育，陰道B超和尿排卵試紙半定量法監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，適時(shí)肌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)5 000～10 000 U，34～36 h后陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。取卵日B超監(jiān)測(cè)下經(jīng)陰道后穹窿穿刺取卵。取卵后第2或第3天行宮腔內(nèi)胚胎移植術(shù)，移植后14 d測(cè)定尿妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性，移植后4周B超檢查宮腔內(nèi)可見孕囊，為臨床妊娠。記錄每位患者使用Gn用量、獲卵數(shù)等。分離出卵丘復(fù)合物后的卵泡液及顆粒細(xì)胞經(jīng)患者夫婦同意用于科研用途。

1.2 分組原則 根據(jù)取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)不同進(jìn)行卵巢反應(yīng)性分組，卵泡直徑為16 mm以上的卵泡數(shù)≤4個(gè)為卵巢低反應(yīng)組(低反應(yīng)組)，卵泡數(shù)5～19個(gè)為卵巢中反應(yīng)組(中反應(yīng)組)，≥20個(gè)為卵巢高反應(yīng)組(高反應(yīng)組)。

1.3 人黃素化顆粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 顆粒細(xì)胞取自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF女性的卵泡穿刺液，每例分離出卵子后的卵泡液離心后的細(xì)胞沉淀物經(jīng)密度梯度法提取顆粒細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，經(jīng)胎盤藍(lán)染色細(xì)胞存活率在85%～90%，將活顆粒細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/ml的單細(xì)胞懸液備用。采用蓋玻片培養(yǎng)法，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上，經(jīng)固定、干燥，用于免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)bcl-2蛋白表達(dá) 使用1∶100兔抗人bcl-2多克隆抗體(一抗)和生物素化第二抗體，DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片，光鏡觀察并照相。Bcl-2定位于胞漿。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定采用組織化學(xué)評(píng)分(histochemistry score,HSCORE)法[3]。排除爬片邊緣的細(xì)胞，瞬時(shí)針盲法選取10個(gè)細(xì)胞分布均勻的視野，每個(gè)視野下計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性染色為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，以i代表染色深淺，根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)弱分為4個(gè)等級(jí)：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。HSCORE=Σpi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示評(píng)分為i的比例)。該評(píng)分法考慮到了單個(gè)細(xì)胞是否陽(yáng)性及其強(qiáng)弱，更客觀地反映細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況。

1.5 RT-PCR測(cè)定bcl-2mRNA表達(dá) 采用Trizol一步法提取總RNA。從NCBI-Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目的基因原始cDNA序列，采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，PCR引物序列如下：β-actin引物擴(kuò)增產(chǎn)物135 bp。上游引物: 5’-CCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物:5’-TCTGGGTCATCTTCTCG-3’。 Bcl-2引物擴(kuò)增產(chǎn)物351 bp。上游引物:5’-CCAGATGGCAAATGACC-3’，下游引物: 5’-TGGCAGGATAGCAGCAC-3’。反應(yīng)體系25 μl，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，各檢測(cè)指標(biāo)上下游引物各1 μl，dNTP(2 mmol/L)2.5 μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μl，Red Tag DNA聚合酶1 μl，雙蒸水16 μl。設(shè)定反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，β-actin、Bcl-2退火溫度分別為53℃、51.5℃，時(shí)間分別為35 s、40 s，72℃延伸30 s，β-actin、bcl-2分別為30、40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。取25 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(120 V，40 min)，0.05 μl/ml Goldview染色，讀膠儀讀取擴(kuò)增條帶的光密度值并進(jìn)行分析、照相。采用目的基因/內(nèi)參的比值表示目的基因 mRNA 表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 人黃素化顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況 分離提純的人黃素化顆粒細(xì)胞培養(yǎng)顯示，細(xì)胞于24 h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)良好，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，見細(xì)胞主要呈星形或橢圓形生長(zhǎng)，細(xì)胞有細(xì)長(zhǎng)的突起，相互連接，細(xì)胞核大，圓，胞漿飽滿富含顆粒。

2.2 人黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá) 隨著患者的年齡、Gn量的增加，bcl-2蛋白HSCORE評(píng)分(以下簡(jiǎn)稱HSCbcl-2)逐漸降低，隨著獲卵數(shù)的增加HSCbcl-2逐漸上升，但bcl-2蛋白表達(dá)與年齡、Gn量的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.3388,P>0.05;r=-0.3417,P>0.05)，而與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(r=0.6183,P<0.01)。隨著卵巢反應(yīng)性的增高，bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高；3組比較，高反應(yīng)組、中反應(yīng)組和低反應(yīng)組bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.2058,P<0.05)；兩兩比較，高反應(yīng)組與中反應(yīng)組和低反應(yīng)組之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.3635,P<0.05;q=4.778,P<0.05)，而中反應(yīng)組和高反應(yīng)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.3461,P>0.05)。見表1，圖1。

2.3 人黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá) 隨著患者的年齡、Gn量的增加，bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸降低，隨著獲卵數(shù)的增加bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸上升；bcl-2 mRNA表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5667,P<0.01)，與Gn量無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r=-0.2914,P>0.05)，而與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(r=0.4584,P<0.05)。隨著卵巢反應(yīng)性的增高，bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸升高；高反應(yīng)組、中反應(yīng)組和低反應(yīng)組bcl-2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.5653，P<0.05)；高反應(yīng)組與低反應(yīng)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.7756,P<0.05)，而中反應(yīng)組和高反應(yīng)組、低反應(yīng)組間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.3026，P>0.05;q=2.500，P>0.05)。見表1，圖2。

表1不同反應(yīng)組bcl-2蛋白表達(dá)(HSCOREbcl-2)和mRNA表達(dá)的比較

組別bcl-2蛋白表達(dá)(HSCOREbcl-2)bcl-2mRNA表達(dá)高反應(yīng)組(n=5)2.7260±0.36000.8673±0.2141中反應(yīng)組(n=19)2.2316±0.4119*0.6724±0.2392低反應(yīng)組(n=4)1.8475±0.4885*0.4409±0.2605*

注：與高反應(yīng)組比較,*P<0.05

高反應(yīng)組 中反應(yīng)組 低反應(yīng)組

圖2 不同反應(yīng)組黃素化顆粒細(xì)胞bcl-2mRNA的表達(dá)

3 討論

3.1 顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)女性生殖的調(diào)節(jié)作用 顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡的形成和發(fā)育，及卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和成熟起重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示：閉鎖卵泡中存在大量的凋亡顆粒細(xì)胞，而健康卵泡中凋亡顆粒細(xì)胞則很少[2]。卵泡顆粒細(xì)胞首先凋亡，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡，觸發(fā)了卵泡閉鎖。IVF卵泡液中獲取的顆粒細(xì)胞，來自于成熟卵泡，即黃素化顆粒細(xì)胞。而對(duì)體外受精促排卵過程中獲得的黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，則是獲得人顆粒細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究的較好實(shí)驗(yàn)方法[3]。

3.2 bcl-2基因和相關(guān)蛋白與凋亡 Bc1-2是研究較廣泛的一種細(xì)胞凋亡信號(hào)基因，bcl-2蛋白可表達(dá)于正常細(xì)胞的激活和發(fā)育過程中，走向凋亡的細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。作為細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡抑制蛋白，bcl-2基因高表達(dá)可明顯維持細(xì)胞的存活[4]。Bcl-2基因?qū)τ诼雅菁?xì)胞凋亡的調(diào)控也具有重要作用。在卵泡閉鎖過程中，bcl-2蛋白參與了顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，能抑制GC凋亡，促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)和排卵[5]。當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖時(shí)，在顆粒細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到凋亡抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物bc1-2蛋白[6]。高濃度的bcl-2蛋白可以干擾細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，另外，bcl-2能阻止脂質(zhì)過氧化物的形成，抑制氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，bcl-2的抗氧化作用和抑制自由基產(chǎn)生，可能是其阻止細(xì)胞凋亡的另一機(jī)制[7]。

3.3 bcl-2基因和相關(guān)蛋白與卵巢反應(yīng)性 Bcl-2是研究較廣泛的一種細(xì)胞凋亡信號(hào)基因，表達(dá)在人卵巢組織中。在卵泡發(fā)育過程中，Bcl-2可抑制卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其分泌雌、孕激素，促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)和排卵，進(jìn)而控制卵母細(xì)胞凋亡，延緩卵泡閉鎖[8]。在卵泡閉鎖過程中，bcl-2參與了顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖時(shí)，在顆粒細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到凋亡抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物bc1-2蛋白[9]。卵巢顆粒細(xì)胞中特異表達(dá)bcl-2的轉(zhuǎn)基因小鼠與普通小鼠比較，其排卵數(shù)和窩產(chǎn)仔數(shù)明顯升高；而卵巢中剔除bc1-2基因的小鼠，其功能卵泡數(shù)目減少，并且沒有卵母細(xì)胞的卵泡發(fā)生[10]。本研究中bcl-2蛋白隨著卵巢反應(yīng)性的升高而表達(dá)上調(diào)，說明卵巢反應(yīng)性與卵泡的顆粒細(xì)胞的凋亡增加有關(guān)，bcl-2參與了卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程，且在顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要的作用。

總之，凋亡可能是卵母細(xì)胞退化形成的潛在機(jī)制，bcl-2家族可能在卵泡發(fā)育中扮演一個(gè)關(guān)鍵作用，這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)提高IVF和相關(guān)技術(shù)提供了一個(gè)重要啟示。

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Studyontherelationshipbetweentheexpressionofapoptosis-relatedbcl-2proteinaswellasmRNAofluteinedgranulosacellsandovarianreactivity

ZHAOZhiming,HAOGuimin,ZHOULiang,etal.DepartmentofReproductiveMedicine,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of apoptosis-related bcl-2 bcl-2 protein as wellas mRNA of human luteined granulosa cells (GCs) and ovarian reactivity.MethodsTwenty-eight infertility cases receiving IVF-ET were enrolled in the study.The experiment was divided into three groups according to ovarian follicle number,low reactivity group,median reactivity group and high reactivity group.The expression of bcl-2 protein of GCs was detected by immunocytochemistry; expression of bcl-2 mRNA of GCs was detected by RT-PCR.Finally the correlation between the expression of apoptosis-related bcl-2 protein as well as mRNA of human luteined granulosa cells (GCs) and ovarian reactivity was analyzed.ResultsThe isolated and purified GCs were cultured and adhered well within 24 hours.Immuocytochemistry examination showed that the HSCORE scoring of bcl-2 protein (HSCbcl-2) was gradually increased with the increase of number of retrieved oocytes,and HSCbcl-2 was positively correlated to number of retrieved oocytes (P<0.01).There were significant differences in HSCbcl-2 of GCs among the three groups (P<0.05).RT-PCR showed that the expression of bcl-2 mRNA of GCs was negatively related with subject’s age (P<0.01),however,which was positively correlated to the number of retrieved oocytes (P<0.05).There were significant differences in the expression levels of bcl-2 mRNA of GCs among the three groups (P<0.05).ConclusionThe expression of apoptosis-related bcl-2 protein and mRNA of luteined granulosa cells is closely correlated to ovarian reactivity.

in vitro fertilization; ovarian response; granulosa cells; B-cell lymphoma/leukemia-2

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.003

項(xiàng)目來源：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展支撐計(jì)劃(編號(hào)：10276105D-88)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科

R 714.1

A

1002-7386(2014)10-1451-03

2013-12-17)