宮頸癌細(xì)胞周期素表達(dá)及意義

陳小燕 許三鵬 陶德定 李小蘭 于世英

·論著·

宮頸癌細(xì)胞周期素表達(dá)及意義

陳小燕 許三鵬 陶德定 李小蘭 于世英

目的研究宮頸癌組織中4種細(xì)胞周期素(cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE)的表達(dá)，探討4種cyclins與放射敏感性之間的關(guān)系。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)42例宮頸癌組織的4種cyclins。每周測(cè)量宮頸局部腫瘤大小，計(jì)算其消退50%時(shí)間(T0.5)。分析4種cyclins表達(dá)與放射敏感性(T0.5)的關(guān)系。結(jié)果宮頸癌組織cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE均有不同程度過(guò)度表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。cyclinA、cyclinE陽(yáng)性的腫瘤其宮頸局部腫瘤消退50% T0.5值小，腫瘤消退快，放射敏感性好，差異有顯著意義(P=0.033，P=0.023)。結(jié)論宮頸癌組織4種cyclins均過(guò)度表達(dá)。宮頸癌組織cyclinA、E的表達(dá)可作為放射敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

宮頸癌；細(xì)胞周期素；放射敏感性；流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞是腫瘤共同存在的普遍規(guī)律。細(xì)胞周期素(cyclin)作為細(xì)胞周期正向調(diào)控因素，在細(xì)胞周期事件的調(diào)控過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)規(guī)律的改變可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖失控和惡性轉(zhuǎn)化，是許多癌基因、抑癌基因作用的主要匯聚點(diǎn)[1]。隨著人們對(duì)細(xì)胞周期分子機(jī)制研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期是一系列cyclin共同調(diào)節(jié)的，其調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)的連續(xù)過(guò)程，因此，單一cyclin的變化不能全面反映其在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)4種cyclins表達(dá)水平進(jìn)行半定量，分析它們與放射敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年7月至2011年3月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院就診的初治宮頸癌患者42例，治療前均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均接受根治性放射治療(體外照射加腔內(nèi)治療)。年齡32～65歲,平均45.7歲。其中鱗癌38例，腺癌4例。FIGO(國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟)臨床分期：Ⅱa期2例,Ⅱb期10例，Ⅲa期3例，Ⅲb期26例，Ⅳa期1例。放療前和放療10Gy后各取宮頸癌組織，制備成單細(xì)胞混懸液，80%乙醇固定于-20℃。收集7例行子宮切除術(shù)的非宮頸癌患者的正常宮頸組織作為正常對(duì)照。其中子宮肌瘤4例，卵巢囊腫2例，卵巢癌1例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 表達(dá)cyclinA、cyclinB、cyclinE的Molt4細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。4種cyclin單克隆抗體(Pharmigen公司)分別加入細(xì)胞管中，4℃孵育過(guò)夜。IgG同型特異性抗體(Sigma公司)替代cyclin單抗作為陰性對(duì)照。PBS洗兩遍。加入FITC- IgG熒光二抗(DAKO公司)，室溫避光放置30 min。每管加入500 μl PBS,10 μl PI,10 μl Rnase，室溫避光放置30 min。經(jīng)雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞用FACSORT流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，獲得cyclin/DNA雙參數(shù)圖像。每周1次測(cè)量宮頸局部腫瘤大小。記錄放療前腫瘤最大直徑。計(jì)算宮頸局部腫瘤消退50%所需的時(shí)間(T0.5)，以天計(jì)算。

1.3 結(jié)果判斷 結(jié)果用Cellquest軟件處理分析，以陰性對(duì)照為參照，高于陰性對(duì)照即為陽(yáng)性表達(dá)，獲得cyclin值，以陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織細(xì)胞cyclinA、cyclinB、cyclinD1及cyclinE均有不同程度過(guò)度表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。正常宮頸組織cyclinA、cyclinB、cyclinD1 和cyclinE均無(wú)表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2 宮頸癌組織cyclins表達(dá)與臨床分期的關(guān)系 cyclinA、cyclinE值在不同臨床分期之間存在顯著差異(P=0.001；P=0.001)，并且隨著臨床分期增高，cyclinA、cyclinE值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)(r=-0.506,P=0.006；r=-0.440,P=0.022)。cyclinB、cyclinD1與臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.672，P=0.069)。見(jiàn)圖2。

2.3 宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值與4種cyclins表達(dá)的關(guān)系 cyclinA、cyclinE陽(yáng)性的腫瘤其宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值小，腫瘤消退快，放射敏感性好(P=0.033；P=0.023)。cyclinB、D1與T0.5之間無(wú)相關(guān)性(P=0.255，P=0.894 )。見(jiàn)表1。

圖1 cyclins的表達(dá)

圖2 cyclins表達(dá)與FIGO分期的關(guān)系

表1 cyclins表達(dá)與T0.5的關(guān)系

3 討論

目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20多種cyclin。對(duì)細(xì)胞周期有明確調(diào)控作用的主要是cyclinA、B、D1～3和E。cyclins對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控主要表現(xiàn)在G1和M期。G1期cyclins主要包括cyclinD1、E。cyclinD1在G1早期表達(dá)，是細(xì)胞周期啟動(dòng)因子,它與CDK4結(jié)合使之活化，對(duì)Rb磷酸化，使細(xì)胞通過(guò)限制點(diǎn)(R點(diǎn))進(jìn)入S期。cyclinE主要在G1晚期發(fā)揮作用,是G1和S期轉(zhuǎn)換的限速因子。CyclinE-CDK2復(fù)合物能使Rb因磷酸化而失活，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。M期cyclin主要有cyclinA和B，在G2和M期交界處發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂。Cyclin的這種關(guān)卡機(jī)制保證分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞的DNA完整性。如果其失調(diào)，使本來(lái)應(yīng)停止增殖或發(fā)生凋亡的細(xì)胞的DNA損傷或復(fù)制錯(cuò)誤未能及時(shí)糾正，細(xì)胞就會(huì)帶著錯(cuò)誤信息進(jìn)入周期循環(huán)而造成惡變[2]。

體外和多種人體腫瘤中均已觀察到無(wú)限制表達(dá)的cyclin的致癌作用。50%的乳腺癌以及食管癌，頭頸鱗癌中均觀察到cyclinD1的過(guò)度表達(dá)[3]。有人對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織進(jìn)行cyclinE檢測(cè)，并與宮頸不典型增生和正常宮頸組織進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織無(wú)cyclinE蛋白表達(dá)，宮頸不典型增生組織有少數(shù)表達(dá)，而在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中有58.52%表達(dá)[4]。本研究的結(jié)果顯示，宮頸癌組織中cyclinA、B、D1、E的表達(dá)較正常組織明顯升高，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%，正常宮頸組織中cyclinA、B、D1、E均無(wú)表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。說(shuō)明cyclin過(guò)表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的臨床分期與 cyclinA、E的值之間存在顯著差異(P<0.01 )，并呈負(fù)相關(guān)(r=-0.506，P=0.006；r=-0.440，P=0.022 )，即隨著臨床分期的升高，cyclinA、E的值呈下降趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]一致，由此表明在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中cyclinA、E的表達(dá)并非呈直線(xiàn)上升，而是呈先上升再下降的趨勢(shì)。在腫瘤發(fā)生的早期，細(xì)胞周期機(jī)制破壞的程度較輕，表現(xiàn)為細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的部分破壞，細(xì)胞周期仍須靠高表達(dá)cyclin的驅(qū)動(dòng)使細(xì)胞越過(guò)檢測(cè)點(diǎn)，完成在正常細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制下難以實(shí)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞克隆的增殖；而在腫瘤的晚期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)可能已完全被眾多異常基因累積的共同作用所破壞，細(xì)胞在無(wú)檢測(cè)的周期中運(yùn)行，細(xì)胞周期易于啟動(dòng)，因而cyclin低表達(dá)。

關(guān)于cyclin與放射敏感性的關(guān)系的研究較少，且結(jié)論不一。Miyata等[6]報(bào)道在食管鱗狀細(xì)胞癌中，用免疫組化方法檢測(cè)cyclinD1和cyclinB1，放射敏感組

與放射耐受組的表達(dá)無(wú)顯著差異；Shintan在41例口腔鱗癌和9株口腔鱗癌細(xì)胞系中檢測(cè)到cyclinD1的過(guò)表達(dá)與放射敏感性的增加相關(guān)[7]；而Milas的研究表明，經(jīng)15 Gy照射后，在高表達(dá)cyclinD1的SCC-VII放射抗拒腫瘤細(xì)胞系中未能誘導(dǎo)顯著的凋亡和PCAN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化，而在低表達(dá)cyclinD1的Oca-I細(xì)胞系中誘導(dǎo)出顯著的凋亡和增殖細(xì)胞的減少[8]。本研究發(fā)現(xiàn)cyclinA、cyclinE的陽(yáng)性表達(dá)率與宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值之間有顯著差異，cyclinA、cyclinE表達(dá)陽(yáng)性者其宮頸局部腫瘤消退50%的時(shí)間T0.5較短，對(duì)放療的反應(yīng)好，放射敏感，表達(dá)陰性者其T0.5較長(zhǎng)，對(duì)放療的反應(yīng)差，放射敏感性差。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)宮頸癌組織4種cyclin，研究其與腫瘤消退50%T0.5、臨床分期等因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織4種cyclins均呈過(guò)度表達(dá)，cyclinA、cyclinE的過(guò)度表達(dá)與宮頸癌的惡性生物學(xué)行為及放射敏感性相關(guān)，可作為放射敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

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Expressionandsignificanceofcyclinsincervicalcarcinoma

CHENXiaoyan,XUSanpeng,TAODeding,etal.DepartmentofOncology,ShunyiDistrictHospitalofBeijing,Beijing101300,China

ObjectiveTo investigate the expression of human major cyclins (cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE),and to explore the correlation between their expression and radiosensitivity in cervical carcinoma.MethodsThe expression levels of the four kinds of cyclins were detected by flow cytometry in 42 cases of local advanced cervical carcinoma tissues before radiotherapy and after treatment with 10 Gy radiation.The time for the tumor to diminish a half (T0.5) was calculated every week.The correlation between the expression of the four kinds of cyclins and radiosensitivity (T0.5) was analyzed.ResultsThe positive expression rates of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE in cervical carcinoma were 64.2%,83.4%,57.0%,69.0%,respectively.The T0.5 value in tumors with positive cyclinA and cyclinE was significantly lower (P<0.05),moreover their radiosensitivities were better.ConclusionThe overexpression of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE exists in cervical carcinoma,which can be used as prediction index for evaluating radiosensitivity in cervical carcinoma.

cervical carcinoma; cyclins; radiosensitivity; flow cytometry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.002

101300 北京市順義區(qū)醫(yī)院腫瘤科

于世英，101300 北京市順義區(qū)醫(yī)院腫瘤科；

E-mail：syyu@tjh.tjmu.edu.cn

R 737.33

A

1002-7386(2014)10-1448-03

2013-11-20)