微生物傳感器的發(fā)展及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

付 強(qiáng) 林初文 陳 群

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2.北京尚洋東方環(huán)境科技股份有限公司，中國(guó) 北京100081）

0 引言

由于人們?cè)谧非蠼?jīng)濟(jì)效益的同時(shí)對(duì)環(huán)境保護(hù)的意識(shí)不夠，環(huán)境污染變得突出，但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法通常需要一定的分析技術(shù)，專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，人們需要找到一種簡(jiǎn)單，快速，便攜的方法來檢測(cè)各種有機(jī)和無機(jī)化學(xué)污染物，生物傳感器可很好的解決這個(gè)問題。 根據(jù)生物傳感器中所用分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)不同， 可以將生物傳感器分為：酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、細(xì)胞傳感器。其中酶?jìng)鞲衅骱臀⑸飩鞲衅餮芯康米疃?，?yīng)用也最為廣泛。 本文主要介紹微生物傳感器的發(fā)展及其在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 微生物傳感器的發(fā)展過程

微生物傳感器是指利用一定的固定化方法將生物敏感元件（對(duì)特定污染物有感應(yīng)能力的微生物菌株）與具有信號(hào)轉(zhuǎn)換功能的介質(zhì)相連，并借助一定的設(shè)備將信號(hào)放大輸出。 由于微生物傳感器的核心部分是具有生物活性的微生物細(xì)胞，而微生物在其數(shù)量、大小、繁殖、遺傳改造等方面均具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此可以滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)中快速簡(jiǎn)單、原位、低成本的要求。

1975 年Devis[1]制成了第一支微生物傳感器。 在微生物傳感器研制中最關(guān)鍵的是微生物的固定技術(shù)，固定后的微生物應(yīng)盡可能保證細(xì)胞活性和避免細(xì)胞從膜中流失， 以延長(zhǎng)微生物傳感器的使用壽命，傳統(tǒng)的生物材料固定方法包括物理吸附、共價(jià)鍵合、交聯(lián)到一定的載體基質(zhì)上或包埋于有機(jī)聚合物的基質(zhì)中，然而這些方法都存在穩(wěn)定期短和固定時(shí)引起微生物的損傷等缺陷。

納米技術(shù)的出現(xiàn)提供另一種更好的固定方法，納米管與聚合物復(fù)合材料用于電化學(xué)傳感具有很多優(yōu)點(diǎn)，如制備簡(jiǎn)單，易于制成同一厚度的膜等，可以有效地提高生物傳感器的重現(xiàn)性。 導(dǎo)電聚合物(如聚吡咯、聚苯胺、聚嚷吩等)制成的導(dǎo)電聚合物膜具有良好的導(dǎo)電性，易于電子在生物活性物質(zhì)與電極之間傳遞， 可用于制作第三代生物傳感器。 10 年前已經(jīng)出現(xiàn)的微生物燃料電池（(Microbial FuelCell，MFC)）技術(shù)正進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期，這些進(jìn)步均有助于促進(jìn)了微生物傳感技術(shù)的發(fā)展。

2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

2.1 大氣檢測(cè)

SO2是酸雨酸霧形成的主要原因， 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很復(fù)雜。Sasaki（1997）將一種氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)制成微生物傳感器，可以監(jiān)測(cè)酸雨中的硫酸鹽。王曉輝等[2]分別以氧化硫硫桿菌和多功能硫桿菌為分子識(shí)別元件，制備了硫化物和亞硫酸鹽微生物電極，實(shí)驗(yàn)證明，電極的響應(yīng)時(shí)間為3～6 分鐘,以氧化硫硫桿菌為分子識(shí)別元件的電極選擇性好， 它對(duì)S2-的線性范圍為0.06～3.0mg/L，對(duì)SO32-的線性范圍為0.7～32mg/L。 但對(duì)于此類傳感器后續(xù)報(bào)道不多。 此外還有用于NO2檢測(cè)的微生物傳感器[3]。

2.2 水質(zhì)監(jiān)測(cè)

2.2.1 BOD 檢測(cè)

生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand)簡(jiǎn)稱BOD，是水體中微生物分解有機(jī)物的過程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的測(cè)定對(duì)控制水體污染具有更重要的意義， 傳統(tǒng)測(cè)定BOD 的方法需要5 天，用傳感器測(cè)定只需十幾至幾十分鐘，胡磊等[4]采用接枝二茂鐵為介體的微生物傳感器測(cè)量污水的BOD。 結(jié)果表明，傳感器的線性范圍為2～300mg/L，連續(xù)測(cè)量20 個(gè)樣品的精密度為4.2%，能連續(xù)工作35天。 通過對(duì)實(shí)際水樣的測(cè)試表明，測(cè)得的BOD 與BOD5，具有良好的相關(guān)性。

雖然微生物電極法可縮短測(cè)定時(shí)間，但微生物固定化膜的制作工藝復(fù)雜且容易污染，同時(shí)單一菌種底物利用范圍有限，在一定程度上限制了微生物電極的使用。 近年來，人們利用從污水和活性淤泥中富集的電化學(xué)活性微生物， 構(gòu)建了多種有介體或無介體微生物燃料電池，同時(shí)發(fā)現(xiàn)電流（電壓）或電子庫(kù)侖量與電子供體的含量之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系， 因此微生物燃料電池能用于某些底物含量的測(cè)定， 如廢水BOD[5]以及有毒物質(zhì)[6]等，其中用于廢水中BOD 測(cè)定的研究最為成熟。

2.2.2 重金屬檢測(cè)

重金屬污染廣泛存在于環(huán)境中，它能通過生物富集作用對(duì)動(dòng)植物及人類產(chǎn)生危害。利用分析化學(xué)方法檢測(cè)重金屬離子對(duì)其生物危害缺乏直接檢定， 生物傳感器檢測(cè)重金屬離子吸引了越來越多的研究興趣。

發(fā)光微生物傳感器是目前生物毒性測(cè)試中研究最多的微生物傳感器之一。最常用的生物發(fā)光系統(tǒng)是用于水體毒性實(shí)驗(yàn)的Microtox 法評(píng)價(jià)。 早在1995 年國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局就頒布了水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。李書鉞[7]以明亮發(fā)光桿菌作為指示生物，研制的傳感器將可同時(shí)分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性作用，該傳感器與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法具有較高的相關(guān)性。

Wang 等[8]采用嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)微生物傳感器毒性分析系統(tǒng)，對(duì)Hg2+、Cu2+、Zn2+、Cr6+、Cd2+、Pb2+、Co2+等重金屬和鄰氯苯酚(2-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、鄰硝基酚(2-NP)、對(duì)硝基酚(4-NP)、四環(huán)素、十二烷基苯磺酸鈉(LAS)等有機(jī)物的生物急性毒性進(jìn)行分析。 試驗(yàn)結(jié)果表明，基于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定期的嗜冷桿菌微生物傳感器具有良好的毒性分析性能。Amaro 等[9]則以四膜蟲（Tetrahymena thermophila MTT1、MTT5）金屬硫蛋白激活子的真核生物熒光素蛋白基因作為信號(hào)載體，開發(fā)全細(xì)胞生物傳感器，其檢測(cè)重金屬離子的靈敏性可與原核生物相當(dāng)。

基因工程微生物在重金屬離子檢測(cè)方面也發(fā)揮了作用。Ravikumar 等[10]通過生物技術(shù)手段將對(duì)Zn2+、Cu2+敏感的兩種啟動(dòng)子融合為雙標(biāo)記報(bào)告蛋白，開發(fā)出檢測(cè)Zn2+、Cu2+的微生物傳感器，最低檢出濃度分別為16μM 和26μM。 Liu 等[11]從惡臭假單胞菌篩選出對(duì)Zn2+的特異性啟動(dòng)子czcR3 融合到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)，研制出用于特異性的檢測(cè)Zn2+含量的生物傳感器。Singh 等[12]固定小球藻于玻璃碳電極膜上研制微生物傳感器監(jiān)測(cè)Hg2+。 具有良好的響應(yīng)時(shí)間、和持久性，電極響應(yīng)的線性Hg2+濃度范圍為10-14M～10-6M，可保持14 天使用期。

用死去的生物被動(dòng)吸收重金屬是一種更有效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的方法。死細(xì)胞與活細(xì)胞相比，不需要營(yíng)養(yǎng)，易于處理和儲(chǔ)存，耐高毒性的反應(yīng)環(huán)境。將銅綠假單胞菌烘干后構(gòu)建微生物傳感器檢測(cè)重金屬Pb2+，得出其對(duì)Pb2+的線性響應(yīng)范圍從1.0μM 到2.0μM，最低檢測(cè)量為0.6μM[13]。

2.3 農(nóng)藥污染監(jiān)測(cè)

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)， 農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分重要的生產(chǎn)資料，而有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphates, OPs)是目前應(yīng)用范圍最廣，使用量最大的農(nóng)藥之一。 由于過度使用OPs 引發(fā)的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，與此同時(shí)人們對(duì)于食品安全問題也日益關(guān)注。 OPs 可以與人體內(nèi)的膽堿酯酶(cholinesterase, ChE)迅速結(jié)合，形成磷酰化膽堿酯酶，使酶失去活力，引發(fā)中毒、致畸等癥狀。 要預(yù)防和處理OPs 引起的環(huán)境和食品污染等問題，使用快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是十分重要的。

Tang 等[14]制備的微生物電化學(xué)傳感器，可迅速檢測(cè)對(duì)硫磷、對(duì)氧磷、甲基對(duì)硫磷濃度。 Anu Prathap 等[15]利用重組大腸桿菌制備測(cè)定有機(jī)氯農(nóng)藥（俗稱林丹）的檢測(cè)的微生物傳感器，其測(cè)定的線性范圍為2～45ppt，且具有高度特異性。 Liu 等[16]開發(fā)一種利用熒光假單胞菌檢測(cè)苯酚和硝基酚的微生物傳感器

2.4 其他監(jiān)測(cè)

三氯乙烯（TCE）用作有機(jī)溶劑和工業(yè)脫脂劑，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。TCE 可被惡臭假單胞菌產(chǎn)生的甲苯雙加氧酶酶降解為為乙醛酸和甲酸離子，可用儀器檢測(cè)。 基于這種反應(yīng)機(jī)理開發(fā)的微生物傳感器可檢測(cè)出20μg L-1～150μg L-1含量的TCE[17]。

郭珺等[18]從沼氣池中分離得到一株能以甲醇為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株M211， 經(jīng)鑒定為嗜有機(jī)甲基桿菌(Methylobacterium organophilium)，傳感系統(tǒng)在0.02%～1% (V/V)甲醇含量范圍內(nèi)測(cè)定，響應(yīng)時(shí)間小于20min，檢出限為0.27mg/L，溶氧消耗量同甲醇含量呈線性關(guān)系，該測(cè)定體系不易受其它干擾物質(zhì)影響，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際樣品濃度一致，該測(cè)定體系具有較強(qiáng)的選擇性，及良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，具有較好的應(yīng)用前景。

甲醛含量已成為當(dāng)今居室、食品、紡織品中污染監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要安全指標(biāo)。 湯鴻雁等[19]以枯草芽孢桿菌為固定化菌株研制出甲醛微生物傳感器，經(jīng)測(cè)試，與乙酰丙酮分光光度法的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。

3 結(jié)語(yǔ)

相對(duì)于酶?jìng)鞲衅?，微生物傳感器最大的?yōu)點(diǎn)就是成本低、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單，所以應(yīng)用市場(chǎng)潛力巨大，但它自身也存在了一定的的缺陷，比如反應(yīng)時(shí)間比酶?jìng)鞲衅饕L(zhǎng)，由于多酶體系的存在，有可能對(duì)復(fù)雜樣品產(chǎn)生非特異性響應(yīng)等。 有待我們進(jìn)一步完善。 開發(fā)新的固定化技術(shù)，利用微生物育種、基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)研制出新型、高效耐毒性的微生物傳感器是該領(lǐng)域科研人員面臨的課題。相信微生物傳感器作為一個(gè)具有發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较?。定?huì)隨著生物技術(shù)、材料科學(xué)、微電子技術(shù)等的發(fā)展取得更大的進(jìn)步，并逐步趨向微型化、集成化、智能化。 最后，檢測(cè)不是目的，美好的環(huán)境需要人們共同呵護(hù)。

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