HPLC法測定龍掌口含液中異阿魏酸含量

★ 戎其月 劉凱 李丹 魏茂陳

(1.揚州市中醫(yī)院藥劑科 江蘇 揚州 225009； 2.貴陽新天藥業(yè)股份有限公司 貴州 貴陽 550010)

龍掌口含液主要是由飛龍掌血根皮、飛龍掌血葉、地骨皮、升麻四味藥材組成，用于治療口臭、復(fù)發(fā)性口瘡(口腔潰瘍)、牙齦炎、牙周炎。方中升麻的主要功效為發(fā)表透疹，清熱解毒，升舉陽氣。用于風(fēng)熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽毒發(fā)斑，脫肛，子宮脫垂[1]。升麻中的阿魏酸和異阿魏酸等咖啡酸衍生物具有較強的抗炎活性，一般認為有機酸是升麻清熱解毒的有效成分，其含量檢測方法有TLC法、HPLC法[2]。質(zhì)量標準制定時擬將其列入含量測定項下對其進行控制，現(xiàn)建立測定龍掌口含液方中的異阿魏酸含量的HPLC法，該方法準確、精密度、重復(fù)性好。

1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀；電子天平(十萬分之一)AE240型(Mettler公司)；異阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111698-200501)，龍掌口含液樣品(貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供，批號：070701)及陰性樣品均由貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供；乙腈為色譜級；水為重蒸餾水；乙醇、磷酸為分析純。

2 方法

2.1 液相色譜分析條件 液相色譜柱為伊利特ODS2 C18柱(250mm×4.6mm,5μm )，流動相為乙腈-0.1%磷酸(13∶87)為流動相，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為316nm，理論板數(shù)按異阿魏酸峰算應(yīng)不低于5000，色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為化學(xué)工作站。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5mL，置25mL量瓶中，加10%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取異阿魏酸對照品適量，置50mL棕色量瓶中，加10%乙醇溶液，溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，取配好的對照品儲備液依次稀釋成依次稀釋成4.4，11，22，33，44μg/mL 5份不同濃度對照品溶液，即得。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實驗 取不含升麻藥材的龍掌口含液藥液，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品后，將適量的缺少升麻的陰性樣品溶液、對照品溶液、供試品溶液，放入高效液相色譜儀中，取樣量設(shè)置為10μL。供試品溶液圖譜與對照品溶液圖譜相同處有相同色譜峰，色譜峰分離度良好，基線穩(wěn)定，整個分析在30min時間內(nèi)完成，陰性樣品無干擾。見圖1。

3.2 線性關(guān)系考察 取配制好的五份不同濃度的對照品溶液進樣量10μL，測定。以濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行一元線性回歸，回歸方程為Y=45.92X-7.2748，r=1，擬合過原點的直線方程為：Y=45.691X，r=1，,結(jié)果表明異阿魏酸在4.4～44μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品

3.3 精密度試驗 取異阿魏酸對照品溶液(22μg/mL)10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，每次進樣10μL，以異阿魏酸峰面積為指標，結(jié)果RSD為0.2%，表明本法精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗 取龍掌口含液(批號：070701)樣品，按2.2平行制備供試品6份，按2.1液相色譜分析條件，依次進樣量10μL，測定異阿魏酸的含量，結(jié)果RSD為1.2%，表明本法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗 分別取六份已知含量的龍掌口含液(批號：070701)5mL，置50mL量瓶中，精密加入上述異阿魏酸對照品溶液(0.249mg/mL)3mL。按2.2項下制備方法平行制備供試品，按2.1液相色譜分析條件進樣10μL，測定異阿魏酸的含量，測定結(jié)果平均回收率為100.1%，RSD%為1.0%。見表1。

3.6 穩(wěn)定性試驗 取龍掌口含液(批號：070701)按2.2制備供試品溶液。按2.1液相色譜分析條件，進樣量10μL，在0，1，2，4，8，12，24 h測定異阿魏酸的峰面積，計算含量，結(jié)果RSD為0.2%，結(jié)果顯示樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 樣品含量測定 取3批樣品，每批2份，按2.2項下制備方法制備供試品溶液，按2.1液相色譜分析條件測定異阿魏酸的含量，結(jié)果見表2。

表1 異阿魏酸加樣回收率試驗結(jié)果表(n=6)

表2 3批樣品含量測定結(jié)果表(n=2, mg/100mL)

4 討論

升麻中含有異阿魏酸、阿魏酸及其他三萜化合物、香豆素等成分[3]。異阿魏酸具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[4]，為本品主要成分之一，2010年版《中國藥典》一部中規(guī)定的升麻定性鑒別及含量測定均以阿魏酸、異阿魏酸作為指標成分。據(jù)文獻報道對所收集的不同產(chǎn)地16批升麻樣品同時測定其中阿魏酸和異阿魏酸，發(fā)現(xiàn)兩種成分的量相差懸殊，異阿魏酸約為阿魏酸的10倍[5]。故本實驗以異阿魏酸的含量測定為檢測指標較為客觀合理。

據(jù)文獻報道，異阿魏酸對照品溶液不穩(wěn)定，見光易水解，對照品曝光室溫放置數(shù)日后含量降低明顯，所以本實驗在配異阿魏酸對照品溶液時使用棕色容量瓶，在冰箱中(4℃)保存，避光處理24h內(nèi)很穩(wěn)定。在提取溶劑的選擇上，分別考察了10%乙醇溶劑、乙酸乙酯萃取后加乙醇溶解、乙醇、水，結(jié)果10%乙醇和水對異阿魏酸的提取較完全，且易于操作，因此，綜合考慮將10%乙醇對供試品進行提取。

[1]國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：68-69.

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[1]Yin J.Modern Studies and Clinical Applications in Traditional Chinese Medicine[M].Beijing:Publishing House of Ancient Chinese Medical Books,1995:260.

[1]劉穎，張小茜.升麻質(zhì)量標準的研究[J].中草藥，2005:36(9):1 402-1 403.