廣東紫珠干浸膏特征圖譜研究*

★ 郭文 付輝政 周國平 廖圓月

(1.江西省食品藥品檢驗所/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004)

廣東紫珠(CallicarpakwangtungensisChun)為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(CallicarpaL.)植物，該屬植物共有190余種，我國有46種，可作藥用的有30種。主要分布于江西、福建、湖北、浙江等地[1]。廣東紫珠收載于2010年版《中國藥典》一部，具有收斂止血，散瘀，清熱解毒之功效。用于衄血，咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血等癥[2]，為民間臨床婦科及各科出血癥的常用藥物[3]。廣東紫珠干浸膏為廣東紫珠經(jīng)水煎煮提取制成的固體，也是治療慢性宮頸炎引起的濕熱下注，赤白帶下，宮頸糜爛，出血等癥抗宮炎系列品種的主要成分之一。目前，國內(nèi)外學(xué)者報道了廣東紫珠含有黃酮苷類、苯丙素糖苷類、三萜類、酚酸類等化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明廣東紫珠具有止血[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抑菌[4,6]、抗炎[4,7,8]等藥理活性。由于廣東紫珠易于與同屬藥用植物混淆，尤其是裸花紫珠和大葉紫珠，導(dǎo)致廣東紫珠干浸膏質(zhì)量無法得到保障。本課題組前期對廣東紫珠水提物進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，研究表明其有效成分是以連翹酯苷B和金石蠶苷為代表的苯乙醇苷類化合物，同時應(yīng)用HPLC法對廣東紫珠、裸花紫珠和大葉紫進(jìn)行了初步的比較，發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷類成分在廣東紫珠、裸花紫珠和大葉紫珠中含量差異非常大，因此對廣東紫珠干浸膏苯乙醇苷類成分進(jìn)行特征圖譜研究具有重要意義。且廣東紫珠干浸膏也是《中國藥典》2015年版起草品種。本試驗運用特征圖譜技術(shù)測定了10個不同批次來源的廣東紫珠干浸膏樣品，建立了廣東紫珠干浸膏的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜并對共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，為廣東紫珠干浸膏質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(四元泵，自動進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器等)；Sartorius BP211D型電子天平(德國賽托利斯集團(tuán))；連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷均為本實驗室自制，通過1H-NMR、13C-NMR、MS等確證了它們的結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC檢測大于98%(面積歸一法測得)；廣東紫珠干浸膏由江西海爾思藥業(yè)有限公司(批號：20130302、20130104)、江西心正有限責(zé)任公司(批號：20130201)、廣西仁信制藥有限公司(批號：20120201)、江西博士達(dá)有限責(zé)任公司(批號：20130102)、懷化正好制藥有限公司(批號：1-1、2-1、3-1、4-1、5-1)提供；乙腈為色譜純，磷酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用Agilent ZRBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；檢測波長：332nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按連翹酯苷B峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷對照品適量，加甲醇分別制成每1mL含連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液(批號：20130201)，按“2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰的積分面積和保留時間。以連翹酯苷B的積分面積和保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20130201)，按“2.1”色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)行測定，記錄特征圖譜，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于2.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗 取同一供試品溶液(批號：20130201)，按照“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”色譜條件，記錄各色譜峰的保留時間和積分面積，以連翹酯苷B為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.1%，相對峰面積RSD均小于2.5%，表明該實驗方法的重現(xiàn)性良好。

表1 共有特征峰相對保留時間

2.5 共有峰的確定 在“2.1”色譜條件下，分別測定10個不同批次的廣東紫珠干浸膏樣品的HPLC特征圖譜(圖1)，選擇穩(wěn)定性較好、吸收性較強(qiáng)、特征較明顯的色譜峰為共有峰，共確定4個共有特征峰，其中連翹酯苷B峰的峰面積較大且穩(wěn)定，以它的保留時間(tR)為參照標(biāo)準(zhǔn)，計算各共有峰的相對保留時間，結(jié)果10批樣品4個共有特征峰的相對保留時間為1.00～2.10，RSD均小于1.4%(表1)。以連翹酯苷B的峰面積為參照標(biāo)準(zhǔn)，計算各共有峰的相對峰面積(表2)。因此確定4個共有峰作為廣東紫珠干浸膏定性分析的特征峰(圖1)。

表2 共有特征峰相對峰面積

1.連翹酯苷B；2.毛蕊花糖苷；3.金石蠶苷；4.異毛蕊花糖苷

2.6 指紋圖譜的建立 將10批廣東紫珠干浸膏的指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版相似度軟件，以表1中樣品編號為20130102的廣東紫珠干浸膏的特征圖譜為參照圖譜，采用多樣本平均數(shù)矢量綜合作為共有模式矢量，時間寬度設(shè)定為0.20，多點校正后，建立自動匹配特征圖譜(見圖2)。

圖2 廣東紫珠干浸膏10個批次的HPLC特征圖譜

2.7 相似度評價 采用藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)，對10批廣東紫珠干浸膏進(jìn)行相似度評價。將廣東紫珠干浸膏特征圖譜導(dǎo)入相似度評價軟件，設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰自動匹配，生成對照特征圖譜，進(jìn)行相似度評價，得到以下結(jié)果,見表3。

2.8 共有峰的鑒定 本課題組利用各種色譜技術(shù)和波譜方法對廣東紫珠干浸膏特征圖譜中的共有峰進(jìn)行了分離和鑒定，鑒定了4個共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，按照時間順序依次為連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷。

表3 廣東紫珠干浸膏相似度數(shù)據(jù)結(jié)果

3 討論

3.1 特征成分的選擇 本課題組前期對廣東紫珠干浸膏進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，研究表明苯乙醇苷類為其特征成分。選擇連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷4個苯乙醇苷類指標(biāo)成分，應(yīng)用HPLC法對廣東紫珠、裸花紫珠、大葉紫珠中4種苯乙醇苷成分進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：廣東紫珠主要成分為連翹酯苷B、金石蠶苷，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量較低；裸花紫珠的主要成分為毛蕊花糖苷，異毛蕊花糖苷和連翹酯苷B含量較低，未測出金石蠶苷；大葉紫珠的主要成分為毛蕊花糖苷，未測出連翹酯苷B、金石蠶苷和異毛蕊花糖苷。上述研究結(jié)果表明：連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷4個苯乙醇苷類能很好的對廣東紫珠、裸花紫珠、大葉紫珠進(jìn)行區(qū)分，故選擇苯乙醇苷類成分作為廣東紫珠干浸膏特征成分。

3.2 溶媒及提取方法考察 試驗中比較過不同的提取溶媒及提取方法，如水、乙醇及不同濃度甲醇，分別回流及超聲處理。最后確定以50%甲醇回流提取效果較好，有更明顯的色譜峰在特征圖譜上體現(xiàn)，能更全面的控制藥材的質(zhì)量，因此選擇了試驗中采用的提取溶媒及提取方法。

3.3 檢測波長的選擇 使用HPLC-DAD對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)332nm為苯乙醇苷類特征波長，同時選擇332nm為特征圖譜的監(jiān)測波長，色譜峰信息最多，可滿足特征圖譜信息最大化原則。

3.4 耐用性試驗考察 選用了不同廠家和不同型號的色譜柱試驗，如：A：YMC-PackODS-A(150mm×4.6mm，5μm)、B：AgilentZRBAXSB-C18(4.6mm×150mm，5μm)、C：DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)的色譜柱，結(jié)果表明，不同廠家的色譜柱分離效果均良好，各共有峰與參

照物峰的相對保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在±5%范圍之內(nèi)。對不同品牌或同一品牌不同型號的儀器進(jìn)行了考察，如：Shimadzu LC-20A系列、Agilent 1200系列及Agilent 1260系列高效液相色譜儀，結(jié)果表明不同廠家或型號的儀器獲得的色譜圖相似度良好，說明本方法能適用于不同的高效液相色譜儀。

本實驗建立了廣東紫珠干浸膏的特征圖譜測定方法，該方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為廣東紫珠干浸膏及其它含廣東紫珠干浸膏中藥復(fù)方制劑制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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