土黃連藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

★ 廖寶源 楊慧敏

(贛州市食品藥品檢驗(yàn)所 江西 贛州 341000)

土黃連為毛茛科植物短萼黃連CoptischinensisFranch.var brevisepala W.T.Wang et Hsiao的干燥根莖。性味苦、寒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)。功能清熱燥濕，瀉火解毒，用于胃腸濕熱，脘腹痞滿(mǎn)，嘔吐，瀉痢，黃疸，高熱神昏，口舌生瘡，心煩不寐，血熱吐衄，目赤腫痛，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿[1,2]。分布于廣西、江西、湖南、貴州等地，江西主產(chǎn)贛州、吉安、宜春、上饒、萍鄉(xiāng)、景德鎮(zhèn)等地，為江西省贛南及吉安地區(qū)民間常用藥[2,3]。短萼黃連富含生物堿，藥效顯著，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，具有廣譜抗生素的作用，常用于治療濕熱內(nèi)蒸、泄瀉痢疾等，且具有抗癌、抗放射及促進(jìn)細(xì)胞代謝等作用[4,5]。土黃連藥材收載于《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1996年版，原標(biāo)準(zhǔn)只有簡(jiǎn)單的性狀和顯微鑒別，未對(duì)藥效成分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，難以控制其藥材及其成方制劑的質(zhì)量和臨床用藥的有效性和安全性。因此，本文在土黃連原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，建立了水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、鹽酸小檗堿的薄層鑒別和含量測(cè)定方法，為土黃連藥材及其成方制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀(VWD檢測(cè)器、四元低壓混合泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation色譜工作站)，DM500攝影攝影顯微鏡(德國(guó)萊卡)，USC302超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)，GZX-DH-40ⅹ45-BS電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，SX2-5-12 C0149箱式電阻爐(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)，梅特勒AB265-S型電子天平。

乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-200208)，10批土黃連藥材為2013年9月收購(gòu)于江西省吉安市遂川縣營(yíng)盤(pán)圩銅鼓村(暫定批號(hào)為T(mén)HL-1-THL-10)，經(jīng)贛州市食品藥品檢驗(yàn)所劉志輝鑒定為毛茛科植物短萼黃連CoptischinensisFranch.var brevisepala W.T.Wang et Hsiao的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材名稱(chēng) 本品民間習(xí)稱(chēng)“黃連”或“土黃連”，為與《中國(guó)藥典》收載的“黃連”相區(qū)別，故將“土黃連”列為正名。

2.2 植物來(lái)源 本品為多年生草本，根狀莖黃褐色，著生眾多須根，多為單枝或有分枝。葉均基生，葉片堅(jiān)紙質(zhì)，長(zhǎng)3～11cm，3全裂，葉中尖裂片具細(xì)柄，卵狀菱形，羽狀深裂，邊緣有銳鋸齒。側(cè)生裂片不等地2深裂，葉柄長(zhǎng)5～18cm；花序有3～8朵花，苞片披針形，羽狀深裂；花小，萼片5，黃綠色，狹卵形，長(zhǎng)約6.5cm，比花瓣長(zhǎng)1/3～1/5；中央有蜜槽；蓇葖果有細(xì)柄[6]。生于山地陰涼處[3]。分布于廣西、廣東、福建、安徽、浙江、江西、湖南、貴州[2,3,7]，江西主產(chǎn)贛州、吉安、宜春、上饒、萍鄉(xiāng)、景德鎮(zhèn)等地。

2.3 藥材性狀 本品多為單枝或有分枝，略呈圓柱形，微彎曲，長(zhǎng)1.5～4.5cm，直徑0.3～0.5cm。表面黃褐色或灰黃色，結(jié)節(jié)緊密排列呈連珠狀，有須根及須根殘基。上部殘留黑色鱗葉，頂端留有殘余的莖或葉柄。質(zhì)硬，斷面不整齊，皮部橙紅色或暗棕色，木部鮮黃色或橙黃色，呈放射狀排列，髓部紅黃色，偶見(jiàn)中空。氣微，味極苦，嚼之唾液可染成紅黃色。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 供試品溶液的制備 取本品粉末0.25g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.3 薄層色譜的展開(kāi) 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干。

2.4.4 顯色 置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.4.5 樣品檢識(shí) 按上述條件對(duì)10批土黃連藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果各斑點(diǎn)分離良好，顯色清晰，且各批藥材薄層鑒別結(jié)果一致性較好。見(jiàn)圖1。

1～5、7～11.土黃連藥材；6.鹽酸小檗堿

2.5 檢查

2.5.1 水分 按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H第一法測(cè)定[8]。見(jiàn)表1。

2.5.2 總灰分 按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K測(cè)定。見(jiàn)表1。

2.5.3 酸不溶性灰分 按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K測(cè)定。見(jiàn)表1。

2.6 浸出物 用稀乙醇作溶劑，照醇溶性浸出物測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅹ A)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定。見(jiàn)表1。

表1 土黃連測(cè)定結(jié)果

2.7 含量測(cè)定 土黃連主要含原小檗堿型生物堿，其中小檗堿含量最高，含量為5.29%～8.52%[3,9,10]。因此本文采用HPLC法建立了土黃連藥材中鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法。

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil(鉆石)C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100mL中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)；檢測(cè)波長(zhǎng)：345nm；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。見(jiàn)圖2。

1.鹽酸小檗堿

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液25mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(106μg/mL)1.0，3.0，5.0，7.0，10.0mL，分別加甲醇稀釋定容至10mL，搖勻，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鹽酸小檗堿的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，得Y=35.7752X-25.7295，r=0.9992。結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.106～1.06μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.5 精密度試驗(yàn) 取本品細(xì)粉約0.1g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定，重復(fù)6次。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.07%，表明儀器精密度良好。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品細(xì)粉6份，每份約0.1g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿含量的RSD為1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品細(xì)粉約0.1g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制備，分別于0，2，4，6，8，12，24h測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.3%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 取本品細(xì)粉6份，每份約0.06g，精密稱(chēng)定，分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(以甲醇-鹽酸(100∶1)為溶劑，濃度為0.212mg/mL)25mL，照供試品溶液的制備方法，自“密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30min”起，依法制成供試品溶液，精密吸取10μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿含量及RSD，結(jié)果表明方法靈敏度高。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.7.9 藥材含量測(cè)定 取本品細(xì)粉約0.1g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件分別測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 實(shí)驗(yàn)考察了環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)、甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(5∶1.5∶3∶1.5∶0.5)、甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶1.5∶3∶1.5∶0.3)等不同展開(kāi)系統(tǒng)，結(jié)果環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑時(shí)主斑點(diǎn)清晰，分離度較好。耐用性試驗(yàn)考察點(diǎn)樣方式(點(diǎn)狀和帶狀)、展開(kāi)溫度(4～30℃)、展開(kāi)濕度(18%～65%)及預(yù)制薄層板和自制薄層板，結(jié)果帶狀點(diǎn)樣，溫度控制在20～30℃，濕度在47%以下時(shí)斑點(diǎn)清晰，分離度較好，且Rf值適中，薄層板對(duì)結(jié)果影響不大，表明該方法耐用性較好。

3.2 浸出物測(cè)定考察 實(shí)驗(yàn)分別采用熱浸法和冷浸法，熱浸法用水、稀乙醇、75%乙醇、乙醇做溶劑，冷浸法用水、乙醇做溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果稀乙醇作溶劑熱浸的浸出率最高，故選取稀乙醇作溶劑熱浸。

3.3 含量測(cè)定

3.3.1 波長(zhǎng)選擇 參考《中國(guó)藥

典》中鹽酸小檗堿的檢測(cè)波長(zhǎng)[8,12]，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為345nm。

3.3.2 流動(dòng)相的選擇 參考《中國(guó)藥典》中鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法，采用乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100mL中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)為流動(dòng)相，結(jié)果對(duì)照品峰形好，保留時(shí)間穩(wěn)定，與其它組分分離較好。

3.3.3 供試品溶液制備的條件考察 實(shí)驗(yàn)考察了采用超聲處理30min、超聲處理1h、回流1h為提取方法，結(jié)果回流比超聲提取率稍高，但考慮環(huán)保及簡(jiǎn)化操作，采用超聲處理30min作為提取方法。

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