蒺藜總皂苷含量測定研究

★ 李艷 胡蓉 王麗靜 漆小勇 曾憲儀

(1.江西省藥物研究所 江西 南昌 330029，2.江西遠健藥業(yè)有限公司 江西 南昌 330100)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥果實，蒺藜總皂苷是從蒺藜中提取出來的甾體皂苷,甾體皂苷是蒺藜的主要有效成分,一般為呋甾醇(furostomol)和螺甾醇(spirostanol)兩類[1]，臨床上用于治療缺血性心腦血管疾病，為藥物“心腦舒通膠囊”的原料，即用蒺藜地上部位提取總皂苷。目前國內(nèi)外對蒺藜的研究方向主要集中在改善性能力強壯作用以及心腦血管等領(lǐng)域[2-4]，且已顯示出良好的應(yīng)用前景?！靶哪X舒通膠囊”質(zhì)量標準中蒺藜總皂苷的含量測定方法為氯化鈷作對照進行含量測定，經(jīng)試驗比較氯化鈷溶液與供試品溶液的最大吸收波長不一致，為了更好的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量，我們從蒺藜總皂苷中分離得到26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，并以此為對照品，采用分光光度法對蒺藜總皂苷進行含量測定。

1 器材與試劑

1.1 儀器 島津UV2550紫外分光光度計(日本島津公司)；電子天平(瑞士Mettler公司M3型)。

1.2 試藥 蒺藜總皂苷(江西遠健藥業(yè)有限公司提供)。對照品：26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，含量>98%(簡稱化合物Ⅱ?qū)φ掌罚峦?，由本單位自制。對二甲氨基苯甲醛、鹽酸、硫酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取化合物Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加70%乙醇制成每1mL中含0.2mg的溶液，即得。

2.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.3，0.5，0.7，0.9，1.0mL，分別置具塞試管中，揮去溶劑，放冷，分別加入E試劑(2g對二甲氨基苯甲醛溶解于50mL濃鹽酸中，加50mL水稀釋即得。)5mL，置40℃水浴中加熱5min，立即取出，于冰水浴中冷卻后，加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL，搖勻，放置30min后，立即測定，以試劑同法操作的溶液為空白。照分光光度法(中國藥典2010年版一部附錄VB)，在520nm±1nm的波長處于，以吸光度為縱坐標，對照品量為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3 測定法 取供試品6mg，精密稱定，用70%乙醇溶解制成每1mL中含0.24mg的溶液(必要時超聲處理)，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1mL，置具塞試管中，照標準曲線的制備項下的方法，自“揮去溶劑”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含蒺藜皂苷對照品的重量，計算，即得。

2.4 測定波長的選擇 分別取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛洼疝伎傇碥展┰嚻?，照上法制備成溶液，?00～600nm波長處進行掃描，測得二者的最大吸收波長均為520nm，故選擇520nm±1nm為測定波長，見圖1。

圖1 化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻返膾呙鑸D1、供試品；2、蒺藜皂苷對照品

2.5 顯色劑的選擇[5,6]為考察最佳顯色劑，參考心腦舒通膠囊的質(zhì)量標準方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理，考察了使用香草醛、E試劑、對二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的效果，其方法分別為：

A：取供試品溶液及對照品溶液適量，揮去溶劑，加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，搖勻，置70℃水浴中加熱15min，立即取出，置冰水浴中冷卻后，加入5mL冰醋酸，搖勻;

B：取供試品溶液和對照品溶液適量，揮去溶劑，加入E試劑10mL，搖勻;

C：取供試品溶液及對照品溶液適量，加入改良對二甲氨基苯甲醛溶液5mL，密塞，搖勻：置58±2℃水浴中加熱2小時，迅即冷卻至室溫，加入硫酸乙醇溶液5mL，搖勻；

D：本方法。

結(jié)果，A、B方法，供試品與對照品在400～700nm掃描，供試品與對照品二者最大吸收波長不同，且圖形差異較大。C方法，加入硫酸乙醇溶液后不顯色。D方法，供試品與對照品在400～700nm掃描，二者最大吸收波長一致，且圖形相似性好見圖1。

2.6 加熱時間的考察 取蒺藜皂苷對照品和蒺藜總皂苷供試品，按上述方法，加E試劑后，在40℃水浴加熱不同的時間，立即取出，于冰水浴中冷卻后，加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL，搖勻，考察顯色后吸收度的變化情況，結(jié)果以加熱5min顯色為高。

2.7 顯色后的穩(wěn)定性考察 取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻?，照上述方法制成溶液，顯色后，在不同的時間測定其吸收度，結(jié)果表明，樣品吸收度呈下降趨勢，但在30～45min內(nèi)趨于平穩(wěn)。故選在顯色后30～45min進行測定。

2.8 標準曲線的繪制 結(jié)果表明，化合物Ⅱ?qū)φ掌吩?.06～0.2mg的范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=3.48X-0.13，相關(guān)系數(shù)r=0.9992(n=5)。

2.9 重復(fù)性試驗 同一批樣品取5份，制成供試品溶液，分別取1mL置5支具塞試管中，揮去溶劑，照前法操作測定，計算得平均含量為46.85%，RSD為0.83%。表明重復(fù)性較好。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.10 回收率試驗 取已知含量的蒺藜總皂苷，加入一定量的化合物Ⅱ?qū)φ掌罚瓷鲜龇椒y定吸收度，計算平均回收率為97.28%，RSD為1.5%，結(jié)果見表1。

2.11 樣品測定 取蒺藜總皂苷三批，按上述測定法測定，結(jié)果見表2。

表2 蒺藜總皂苷樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 對照品的選擇 蒺藜總皂苷的含量測定方法最早來源于心腦舒通膠囊質(zhì)量標準，是用氯化鈷做對照，經(jīng)比較氯化鈷溶液和供試品溶液最大吸收波長不一致，計算方法繁瑣，為更好的準確的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量，我們從蒺藜總皂苷中分離得到一單體化合物作為對照品，其溶液和供試品溶液顯色后在400～600nm波長范圍內(nèi)進行掃描，二者圖譜相近，最大吸收波長一致，可作為對照品檢測蒺藜總皂苷的含量。

3.2 顯色試劑和反應(yīng)溫度的選擇 參考心腦舒通膠囊的標準方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理，考察了香草醛、對二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的顯色效果，均不太理想，回收率都達不到要求。實驗中受薄層鑒別研究啟發(fā)，薄層板通過E試劑顯色后，再噴以硫酸乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)斑點在高溫天氣下不需加熱就能清晰的顯現(xiàn)。于是我們選擇E試劑加硫酸乙醇溶液作為反應(yīng)試劑。反應(yīng)溫度定為40℃。

3.3 本方法采用蒺藜中的單體皂苷成分作為對照品，反應(yīng)過程可控，可操作性強，用來檢測蒺藜總皂苷的含量準確可靠，具有創(chuàng)新性。

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