形覺剝奪性近視/弱視對小鼠高血糖視網膜微血管病變影響的形態(tài)學觀察

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(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院眼科，四川 成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院西南眼科醫(yī)院，重慶 400038)

高度近視合并糖尿病的患者一般不易發(fā)生糖尿病視網膜病變(DR)，或不會進展成為增值性糖尿病視網膜病變。目前，高度近視所致視網膜血管網微結構改變尚缺少相關研究報道。而高度近視是否通過穩(wěn)定血-視網膜內屏障而影響DR早期改變，也有待動物實驗研究證實。因此，本研究擬觀察單純高血糖動物及高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視動物模型眼視網膜在DR早期表現(血-視網膜內屏障損傷)中的變化。本研究通過過碘酸-雪夫氏液(PAS)染色、免疫熒光標記觀察比較高血糖小鼠與高血糖合并形覺剝奪的小鼠視網膜微血管形態(tài)學的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鏈脲菌素(STZ)由美國Invitrogen公司提供，胰蛋白酶由美國Alexis公司提供，雪夫氏液、過碘酸、HE試劑均由美國BBI公司提供，鬼筆環(huán)肽-FITC由美國Sigma公司提供，DAPI試劑由北京碧云天公司提供，血糖儀及試紙均為羅氏公司產品，共聚焦熒光顯微鏡為Leica公司產品，光學顯微鏡為日本Olympus公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 形覺剝奪性近視/弱視小鼠模型的建立及分組 BALB/cJ小鼠(1月齡)10只(購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)，作為正常對照組(Ⅰ組)，BALB/cJ乳鼠(生后10 d)40只，分為2組，每組20只，其中10只用于PAS染色，10只用于鬼筆環(huán)肽-FITC免疫熒光雙標觀察。Ⅱ組為高血糖組，Ⅲ組為高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組。乳鼠均由母鼠喂養(yǎng)，成年后(生后30 d)即給予正常飼養(yǎng)；高血糖組小鼠于出生后30 d經左下腹小量、多次注射STZ；高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組于生后10 d縫合右眼瞼，生后30 d經左下腹小量、多次注射STZ。3組小鼠自生后37 d起每日1次取尾血測量血糖，生后第72～77天齡時，稱量體質量，乙醚麻醉，于暗室下檢影驗光，獲得小鼠眼球屈光度值。完成以上測量后，處死小鼠并取出視網膜置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2 小鼠視網膜血管網鋪片及染色 ①視網膜血管網消化和鋪片：取固定的視網膜，置于蒸餾水中浸泡；將視網膜置于pH 7.8的3%胰酶-tris緩沖液中，37 ℃消化至視網膜表層組織大部松脫；取出視網膜，浸泡于蒸餾水中，清洗直至僅剩半透明組織；將該組織轉移至載玻片上，烘片1 h。②PAS染色實驗：配置PAS溶液；0.5%過碘酸氧化視網膜血管網鋪片10 min；沖洗2次，蒸餾水沖洗1次；將載玻片浸入schiff液中，避光20 min；亞硫酸鈉滴洗鋪片2次，蒸餾水洗1次；蘇木精淡染15 s后，二甲苯透明；封片保存。③鬼筆環(huán)肽-FITC、DAPI熒光雙標實驗：將鬼筆環(huán)肽-FITC加入0.1%PBS中稀釋至5 μg/mL；每張鋪片滴加1% Triton 20 μl，浸泡破膜1 h；蒸餾水沖洗并晾干；每張鋪片滴加稀釋的鬼筆環(huán)肽-FITC 20 μl，置于避光濕盒中，孵育3 h；避光條件下蒸餾水沖洗鋪片并晾干；每張血管網鋪片滴加DAPI 20 μl，置于濕盒中，避光，孵育5 min；避光，蒸餾水沖洗血管網鋪片并晾干，抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.3 小鼠視網膜血管網內皮細胞、周細胞計數 光學顯微鏡下周細胞核位于血管外，呈短棒狀，染色較深，內皮細胞核位于血管內，呈長梭狀，染色較淺。激光共聚焦層掃時，每張視網膜血管網鋪片采集9個點，可見周細胞核位于血管周圍，呈短棒狀或小三角狀，有時可與內皮細胞核重疊，內皮細胞核位于血管內，呈長梭狀或棒狀。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PAS染色下周細胞與內皮細胞

視網膜血管網鋪片上(圖1)周細胞核呈短棒狀，染色較深，位于血管周圍，內皮細胞核呈長梭形，染色較淺，位于管腔內。高血糖組鋪片可見無細胞結構血管。高血糖合并形覺剝奪組小鼠視網膜鋪片則較少見到無細胞結構血管。

高血糖組小鼠內皮細胞/周細胞比值(圖2)較對照組顯著增高(P<0.01)，說明高血糖組小鼠視網膜血管網周細胞凋亡顯著增多，高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組周細胞與內皮細胞比值較單純高血糖組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，說明形覺剝奪性近視/弱視組周細胞凋亡減少。

a：正常對照組；b：高血糖組；c：高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組；↑：周細胞核；★：內皮細胞核；▲：無細胞結構血管

圖1小鼠視網膜血管網鋪片PAS染色形態(tài)學觀察(×1000)

*：與Ⅰ組比較，P<0.01；#：與Ⅲ組比較，P<0.01

2.2 鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色形態(tài)學觀察

3小鼠鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色下視網膜血管網形態(tài)學觀察見圖3。鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色與PAS染色的形態(tài)學比較見圖4。圖4b中左下方箭頭(↑)所指為一個與內皮細胞核平行的周細胞核，形狀不典型，為類似于內皮細胞核的梭形，但在共聚焦掃描下可以清晰地看到該細胞突出于血管腔之外；左上方箭頭(↑)所指為一個位于血管背面，難以辨認的周細胞核，但通過層掃可以清楚地看到其熒光在血管腔之外，形狀呈典型的短棒狀；右上方箭頭(↑)所指為一個與內皮細胞核重疊的周細胞核，在共聚焦掃描三維重建中可以看到此處實際上有一個較長的內皮細胞核和一個突起的短棒狀周細胞核。

3 討論

血-視網膜內屏障是DR主要的滲漏點[1]。血-視網膜內屏障損傷在DR早期即可出現，主要表現為毛細血管基底膜增厚、周細胞凋亡等[2]。在胚胎血管成熟過程中，周細胞被認為決定著從新生血管成熟的過程，內皮細胞不能單獨完成血管形成過程[3]。血管形成后，周細胞通過多種細胞因子途徑被募集到新生的血管周圍，周細胞募集抑制將引起血管的異常重構[4-5]，失去接觸抑制的內皮細胞肥大，向管腔突出，堵塞管腔形成無細胞結構血管，進而導致視網膜無灌注區(qū)形成[6]。而內皮細胞有絲分裂抑制的減弱，可導致微血管瘤形成。因此，周細胞凋亡被認為是高血糖視網膜損傷的特征性表現。視網膜毛細血管周細胞喪失可表現為血管內皮細胞/周細胞比值升高。因此本研究使用內皮細胞/周細胞比值來間接反映周細胞的凋亡，并觀察到內皮細胞/周細胞比值明顯上升出現在小鼠實驗性高血糖早期。證實了在高血糖早期，已經出現了血-視網膜內屏障損傷。

a：正常對照組；b：高血糖組；c：高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組；↑：周細胞核；★：內皮細胞核；▲：無細胞結構血管

a：PAS染色；b：鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色；↑：周細胞核；★：內皮細胞核；◆：難以辨別的細胞核

圖4小鼠視網膜血管網周細胞、內皮細胞PAS染色及鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色(×1000)

Lim等[7]通過一項692例的臨床觀察發(fā)現，同時患有高度近視的糖尿病患者，較僅有糖尿病的患者其增殖性DR發(fā)生率明顯降低，其中，一眼患有高度近視，另一眼無明顯屈光不正的糖尿病患者，其患有高度近視的一眼不發(fā)生DR或僅發(fā)生非增殖性DR，這或許提示高度近視對DR的發(fā)生發(fā)展有延緩作用。這種作用可能與高度近視患者眼軸增長，視網膜血流量減少，對血管的破壞也相應減少有關，也可能與高度近視患者變薄的視網膜需氧量更少有關[8-9]。然而，另一些臨床觀察認為，高度近視發(fā)病率較高的人群同樣也是DR高發(fā)的人群，提示高度近視與糖尿病視網膜病變并無相關性[10]。目前，高度近視對糖尿病視網膜病變的保護作用尚缺乏動物實驗證實。本研究證實形覺剝奪組小鼠視網膜周細胞丟失輕于高血糖組，提示形覺剝奪性近視/弱視合并高血糖組小鼠血-視網膜內屏障損傷較單純高血糖組更輕，為進一步研究形覺剝奪性近視/弱視對高血糖視網膜損傷保護作用的可能機制和途徑打下基礎。但由于小鼠體質量輕，持續(xù)高血糖導致其死亡率明顯上升。因此，本實驗中觀察時間短，加長病程的觀察還有待進一步研究。另外，經腹腔小量多次注射STZ造成高血糖被認為是Ⅰ型糖尿病的經典模型，而人類糖尿病視網膜病變多發(fā)生在Ⅱ型糖尿病患者。因此，Ⅱ型糖尿病合并形覺剝奪性近視/弱視動物模型的視網膜微血管改變尚需進一步研究。

此外，傳統(tǒng)實驗中周細胞的識別主要依賴于其形態(tài)及與血管的毗鄰關系，但周細胞的排列、長度、形態(tài)多變，因此PAS染色在光鏡下不能很好地區(qū)分周細胞和內皮細胞。周細胞起源和功能具有多樣性，目前也沒有特異性的周細胞標志物。因此，本實驗采用了肌動蛋白抗體鬼筆環(huán)肽和DAPI兩種無特異的抗體雙標視網膜血管網，并采用激光共聚焦層掃后三維重建來計數周細胞和內皮細胞。有利于觀察一些形態(tài)和位置不典型的周細胞核。該方法目前尚未見文獻報道。

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