機械通氣致大鼠肺損傷時肺組織PPARγ表達的變化

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(山東省腫瘤醫(yī)院麻醉科，山東 濟南 250117)

機械通氣引起的肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是指應(yīng)用呼吸機過程中由于機械通氣諸多因素和肺部原發(fā)病共同作用導致的肺組織損傷，發(fā)生率占機械通氣的0.5%～39%。研究表明，機械通氣導致炎性細胞活化并促進細胞因子釋放，由此激發(fā)肺內(nèi)或肺外組織的炎癥反應(yīng)，從而導致或加重急性呼吸窘迫綜合征或多系統(tǒng)器官衰竭[1-2]。過氧化體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)屬于核內(nèi)受體，共有α、β和γ 3個亞型。已發(fā)現(xiàn)PPARγ廣泛表達于肺泡巨噬細胞和中性粒細胞中，它可以調(diào)節(jié)胰島素敏感性，參與體內(nèi)的新陳代謝，并在炎癥過程起主要作用；還參與調(diào)節(jié)細胞增長、分化、凋亡。PPARγ能夠通過干擾趨化因子的表達，調(diào)節(jié)肺泡巨噬細胞抗炎活性，限制過多傷害性的肺內(nèi)炎癥。近年的研究顯示，在內(nèi)毒素導致的肺損傷中，PPARγ的表達下調(diào)且NF-κB p65水平升高[3-4]。PPARγ在通氣相關(guān)性肺損傷方面的研究尚未見報道。本研究擬從此入手，通過觀察PPARγ在通氣相關(guān)性肺損傷大鼠肺組織中的表達，以期進一步揭示通氣相關(guān)性肺損傷機制，為臨床預防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔雄性SD大鼠63只，體質(zhì)量370～390 g(由山東大學醫(yī)學院動物實驗中心提供)，隨機分為3組(n=21)：大潮氣量(Tidal volume,VT)組，Vt=12 mL；小潮氣量組,Vt=6 mL；自主呼吸組。每組再根據(jù)通氣時間分為3個亞組(n=7)：通氣1 h組、4 h組和8 h組。

1.2 方法

各組動物均在適應(yīng)實驗室環(huán)境72 h后麻醉,術(shù)前夜禁食，自由飲水。20%烏拉坦0.8 mL/100 g腹腔注射麻醉，右頸總動脈穿刺置管，測動脈壓；左股靜脈插管用于輸液和給藥，用微量輸液泵以10 mL·kg-1·h-1速度輸注輸林格氏液，大潮氣量組、小潮氣量組給予肌肉松弛劑阿曲庫胺，用生理鹽水配制成2 mg/mL,先給負荷量1～2 mg/kg,繼而以4～5 mg·kg-1·h-1輸注速度維持。用14號BD留置針行氣管插管，口腔內(nèi)填塞無菌紗布以防止漏氣。各項操作完畢后穩(wěn)定20 min，開始實驗。機械通氣：接小動物呼吸機(浙江大學醫(yī)學儀器廠,DH150型)，呼吸參數(shù)設(shè)定：Vt按照實驗各組要求設(shè)置，吸/呼(I∶E)比為1∶1，呼吸頻率60～70 次/分，呼氣末CO2分壓維持在35～45 mmHg，呼氣末正壓(PEEP)為0,吸入室內(nèi)空氣(氧濃度為21%)。各組分別于通氣1 h、4 h和8 h末頸總動脈放血處死動物。

測定肺灌洗液中蛋白總量、白細胞計數(shù)，測定肺組織濕/干重比(W/D) ，取頸動脈血4 mL后處死大鼠。立即開胸取出肺,左肺用4 ℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗。收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，低溫離心(1 200 rpm，4 ℃，10 min)，待上清液等分后置于-70 ℃保存，用于測定總蛋白(TP)含量，沉淀物用磷酸緩沖液稀釋后光鏡下行白細胞(WBC)計數(shù)；右上葉肺組織用于病理學檢查，右中葉肺組織稱濕重后置于烤箱中,70 ℃烘烤至恒重后稱干重。計算肺W/D。剩余右肺迅速放液氮中凍實，留做RNA提取備用。Tripure法提取肺組織總RNA,紫外分光光度計測定D(260)，計算RNA濃度。RTPCR:按試劑盒說明配置反應(yīng)體系,在PCR儀中進行反應(yīng)。先逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA,以此為模板進行擴增:94 ℃變性45 s；58 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s；共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)體系(cDNA 2 μl,10×PCR buffer 5 μl，MgCl24 μl,dNTP 0.5 μl)。所用引物均源自GenBank中大鼠PPARγ和GAPDH全長cDNA序列,經(jīng)Primer 5.0軟件設(shè)計,由日本TaKaRa Biotech公司合成。擴增產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析成像，western blot檢測PPARγ蛋白的變化，引物序列及反應(yīng)條件見表1。

表1 PPARγ擴增反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變

大潮氣量組通氣4 h、8 h后肺組織病理改變明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細胞，部分肺泡腔內(nèi)有滲出液；小潮氣量組肺組織病理改變不明顯，僅在8 h后有少量白細胞浸潤；而自主呼吸組自主呼吸，肺組織無顯著病理改變，見圖1。

a:大潮起量組;b:小潮起量組

2.2 各組大鼠肺W/D和BALF中WBC、總蛋白的比較

大潮氣量組通氣4 h、8 h后肺W/D和BALF中WBC、總蛋白量明顯增多，與其他組比較差異顯著(P<0.01)，而通氣1 h后各組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

2.3 PPARγ mRNA和PPARγ蛋白表達的比較

N組通氣4 h、8 h后肺組織PPARγ mRNA和PPARγ蛋白表達下降，與其他組比較差異顯著(P<0.01)，而通氣1 h后各組比較無顯著差異(P>0.05)，見表3、圖2。

大潮氣量機械通氣4 h、8 h后，RT-PCR電泳結(jié)果顯示PPARγ mRNA表達下調(diào)，與對照組相比，顯著下降(P<0.01)，見圖2。

1:小潮氣量通氣8 h;2:大潮氣量通氣1 h;3:大潮氣量通氣4 h;4:大潮氣量通氣8 h

圖2PPARγ mRNA表達變化

3 討論

機械通氣是臨床救治呼吸衰竭患者的重要方法，也是全身麻醉患者必用的方法。但是，其引起的并發(fā)癥尤其在ICU中，越來越受到重視。由此引起的肺損傷稱為通氣相關(guān)性肺損傷，發(fā)生機制主要在：容積傷(或稱容量傷)、剪切力傷和生物性損傷。肺保護性的通氣策略既是針對此而提出的，以小潮氣量、容許性高CO2血癥和適度PEEP為主[5]。研究發(fā)現(xiàn)，機械通氣導致或加重肺血管通透性增加、炎性細胞積聚和細胞因子釋放[6]。Tremblay等[7]研究發(fā)現(xiàn),機械通氣在肺內(nèi)炎癥因子(包括TNFα、IL,MIP等)的產(chǎn)生和釋放以及導致肺損傷加重的過程中起著重要的作用，其機制目前并不十分清楚容積傷或稱生物性損傷被認為在VILI中起主要作用[8-9]，過大的潮氣量導致肺泡反復張開與關(guān)閉，產(chǎn)生剪切力傷，并最終導致VILI。PPARγ屬于核激素受體超家族，在調(diào)控脂肪細胞分化、脂質(zhì)和糖類代謝以及炎癥控制等方面具有重要作用，已有多個研究認為PPARγ參與肺損傷過程[10-11]。通常情況下，PPARγ與視黃醛X受體形成異源二聚體，并與輔抑制因子結(jié)合成復合物,處于失活狀態(tài)。當PPARγ與特異性配體結(jié)合后,導致PPARγ與視黃醛X受體形成的異源二聚體的空間構(gòu)象發(fā)生改變，與輔抑制因子脫離，再通過與相應(yīng)靶基因啟動子上的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合,激活靶基因轉(zhuǎn)錄[12-13]。已有研究表明內(nèi)皮細胞PPARγ能夠抵抗內(nèi)毒素導致的肺損傷[14]，而CO2在治療急性肺損傷時PPARγ蛋白表達上升[15]。這些都說明PPARγ在肺損傷機制中起著重要作用。

表2 大鼠肺W/D和BALF中WBC、TP的比較

*：與大潮氣量組相應(yīng)時間比較，P<0.01

表3 PPARγmRNA和PPARγ蛋白表達的比較

*：與大潮氣量組相應(yīng)時間比較，P<0.01

本研究中用自主呼吸作為對照，不同潮氣量進行比較。肺組織W/D和BALF中TP的變化可較好地反映肺間質(zhì)及肺泡血管通透性改變，以及肺受損的程度；WBC計數(shù)可反映白細胞的浸潤及炎癥反應(yīng)的水平。潮氣量是機械通氣最基本的參數(shù),過大易引起通氣過度、氣壓傷、循環(huán)功能紊亂等并發(fā)癥，Vt過小易引起通氣不足、肺泡萎陷、肺內(nèi)分流增加等并發(fā)癥。本試驗選用常規(guī)大Vt(10～12 mL/kg)和低Vt(6～8 mL/kg),并以正常自主呼吸作為對照，實驗結(jié)果顯示：大潮氣量組(即N組)在通氣4 h后即出現(xiàn)肺組織損傷，表現(xiàn)為W/D增加，BALF中TP和WBC含量升高；肺組織病理改變明顯,肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細胞,部分肺泡腔內(nèi)有滲出液。通氣8 h后，損傷繼續(xù)；與小潮氣量組即C組和自主呼吸R組比較，差異顯著。N組4 h和8 h相比，無顯著差異，說明大潮氣量長時間機械通氣導致VILI，而C組在長時間通氣4～8 h后,較1 h相比，肺間質(zhì)有水腫，BALF中TP和WBC含量也增高，但差異無顯著意義?？赡苁欠巧硇缘臋C械通氣使肺泡反復萎陷產(chǎn)生剪切力, 引起上皮細胞和肺泡細胞的牽拉和肺泡巨噬細胞活化，激活肺部炎癥級聯(lián)反應(yīng)和化學介質(zhì)的產(chǎn)生等機制，進一步導致VILI。不同的研究顯示潮氣量在20 mL/kg和15 mL/kg通氣2 h就能導致大鼠肺損傷。本實驗中，潮氣量設(shè)為12 mL/kg，但通氣時間延長，也導致大鼠的肺損傷。本實驗結(jié)果顯示，N組通氣4～8 h后，PPARγmRNA和PPARγ蛋白減少，而通氣1 h無顯著變化。小潮起量組及自主呼吸組無肺損傷，PPARγmRNA和PPARγ蛋白未見明顯下降。可能是長時間大潮氣量機械通氣后，機體抗炎物質(zhì)減少，而損傷持續(xù)，導致VILI。

本研究結(jié)果表明，大潮氣量(12 mL/kg)持續(xù)4 h以上機械通氣對大鼠造成肺損傷，同時伴有PPARγmRNA和PPARγ蛋白的減低，說明PPARγ在通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生機制中起了重要作用。應(yīng)用PPARγ的激活劑或抑制劑能否抑制或促進通氣相關(guān)性肺損傷，以及PPARγ通過何種途徑參與肺損傷值得繼續(xù)研究。

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