坐骨神經(jīng)損傷后雛菊葉龍膽的修復(fù)作用實(shí)驗(yàn)研究

，，，，，

(1.內(nèi)蒙古包鋼第三職工醫(yī)院外二科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

坐骨神經(jīng)損傷臨床比較多見，發(fā)病率高、癥狀明顯、危害較大[1]。因此，坐骨神經(jīng)損傷后如何能有效促進(jìn)損傷神經(jīng)功能再生，提高修復(fù)治療效果，一直是臨床和基礎(chǔ)的關(guān)注焦點(diǎn)，也是一個(gè)迄今沒有完全解決的難題。中藥治療有著整體和局部雙重兼顧的優(yōu)勢(shì)，其過程也符合神經(jīng)損傷修復(fù)的綜合過程[2]，是非常具有發(fā)展前景的治療方式。睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)能促進(jìn)多種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，具有多種生物活性[3]，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有重要意義[4]。雛菊葉龍膽(Bellidifolin)為龍膽科1年生植物，全草入蒙藥，蒙古族醫(yī)學(xué)上作為“桑地格”使用，有清熱解毒的功效。近些年發(fā)現(xiàn)，該藥對(duì)腦出血、腦血栓等腦血管疾病也有很好的療效[5-6]。盡管許多研究都報(bào)道其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)周圍神經(jīng)功能恢復(fù)方面的研究尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道并不多見。因此，我們以大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型來進(jìn)行觀察，探討雛菊葉龍膽是否對(duì)神經(jīng)損傷有促進(jìn)功能修復(fù)的作用，并探討其作用機(jī)制中是否有局部釋放睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的機(jī)制參與。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

取2月齡清潔成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，共225只。動(dòng)物及飼料均購(gòu)于內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SCXK(蒙)2002-0001)，實(shí)施手術(shù)前先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d。雛菊葉龍膽由包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，用生理鹽水配成25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg不同濃度的藥液，置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。甲鈷胺片?gòu)于北京星吳醫(yī)藥有限公司，每片0.5 mg，用生理鹽水配制成100 μg/kg的溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)損傷模型的制備 10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，仰臥固定、脫毛、消毒，無(wú)菌條件下右下肢股后縱切口約1.5 cm，分離骨骼肌，充分顯露并游離坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣0.8 cm處離斷，縫合神經(jīng)外膜并做標(biāo)記，逐層關(guān)閉切口。所有操作均由1人完成。術(shù)后觀察動(dòng)物清醒后，分籠飼養(yǎng)，勤換墊料以防止足底潰瘍發(fā)生。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將造模成功的大鼠以每組45只隨機(jī)數(shù)字表法分為5組。實(shí)驗(yàn)組以25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg的劑量分別腹腔注射雛菊葉龍膽，連續(xù)5周，每天1次。甲鈷胺組注射100 mg/kg甲鈷胺，該藥廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)病的臨床治療；對(duì)照組給予同樣劑量生理鹽水。各組又都以右側(cè)為損傷側(cè)，左側(cè)為健康對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。

1.2.3 檢驗(yàn)指標(biāo)及方法 于第1周、3周、5周時(shí)重新麻醉動(dòng)物，將原來的切口切開，暴露出坐骨神經(jīng)吻合口處。采用BL-420 F電生理儀檢測(cè)記錄神經(jīng)平均傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocities,MNCV)。取手術(shù)側(cè)腓腸肌，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，脫水、石蠟包埋、切片及HE染色。利用Imagin-J圖像軟件放大1 000倍下進(jìn)行測(cè)量計(jì)算肌細(xì)胞截面積，求其平均值。術(shù)后3周時(shí)，取切口吻合處遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)組織5 mm，正常側(cè)也取相應(yīng)節(jié)段的神經(jīng)組織，用4%多聚甲醛PBS液進(jìn)行固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片及烤片，按照購(gòu)買的免疫組化試劑盒說明方法，對(duì)切片的CNTF蛋白進(jìn)行檢測(cè)，攝取圖像。每組隨機(jī)取15張切片，顯微鏡下圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞面積與總面積比值，分析計(jì)算每組細(xì)胞的陽(yáng)性比率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定值

第1、3、5周檢測(cè)記錄神經(jīng)平均傳導(dǎo)速度結(jié)果見表1。各組大鼠的坐骨神經(jīng)平均傳導(dǎo)速度檢測(cè)中，生理鹽水組在1、3、5各周都較低，而甲鈷胺組傳導(dǎo)速度值較高，與生理鹽水組、雛菊葉龍膽25 mg組相比，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。但在各時(shí)間點(diǎn)雛菊葉龍膽25 mg組與生理鹽水組相比，差異不明顯，還不能說明這二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.17)。而雛菊葉龍膽50 mg組與75 mg組相比，差異也沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而這2組與甲鈷胺組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。

表1 各時(shí)間段坐骨神經(jīng)平均傳導(dǎo)速度

*：與生理鹽水組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.01;#：與生理鹽水組、甲鈷胺組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.05

2.2 腓腸肌肌細(xì)胞截面積測(cè)量結(jié)果

利用Imagin-J圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組大鼠不同時(shí)間的腓腸肌HE染色切片(圖1)中肌細(xì)胞截面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。術(shù)后3周可見甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組與75 mg組細(xì)胞截面積較大。細(xì)胞排列整齊，緊密。生理鹽水組可見細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增加。其中甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組與其他組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)，而這3組之間無(wú)顯著性差異。

表2 各組不同時(shí)間腓腸肌細(xì)胞截面積

*：與其他組比較，P<0.05

2.3 免疫組化檢測(cè)CNTF結(jié)果

各組分別于第3周行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)坐骨神經(jīng)中CNTF，檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總面積的比例結(jié)果見圖2。由圖中可見生理鹽水組與雛菊葉龍膽25 mg組比較，2者之間沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這2組與甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)，而在甲鈷胺組與雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組之間相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。

3 討論

平均傳導(dǎo)速度作為電生理的一項(xiàng)指標(biāo)，其值大小與纖維直徑、髓鞘厚度及成熟程度有關(guān)[7]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包繞軸突形成髓鞘和神經(jīng)膜，在神經(jīng)纖維的再生修復(fù)中起誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)及促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和成熟的作用[8]。坐骨神經(jīng)損傷后，肌細(xì)胞直徑及其截面積隨失神經(jīng)支配時(shí)間的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性下降，是肌肉萎縮的可靠形態(tài)學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中雛菊葉龍膽各劑量組與甲鈷胺組相比，甲鈷胺對(duì)改善坐骨神經(jīng)離斷縫合術(shù)后功能恢復(fù)方面作用相對(duì)要優(yōu)于雛菊葉龍膽25 mg組，可能因?yàn)榕R床應(yīng)用雛菊葉龍膽也是組入方劑，單獨(dú)用藥效果不如聯(lián)合其他中、蒙藥使用效果好。提示本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步的研究可以在蒙藥的組合作用方面進(jìn)行深入研究。

a：生理鹽水對(duì)照組；b：甲鈷胺組；c：雛菊葉龍膽25 mg組；d：雛菊葉龍膽50 mg組；e：雛菊葉龍膽75 mg組

*:與生理鹽水組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.05

雛菊葉龍膽25 mg組的效果與其他2組相比，在提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)傳導(dǎo)速度和腓腸肌肌細(xì)胞截面積方面，效果相對(duì)差一些，結(jié)果有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？紤]該藥物的作用也有一定的濃度范圍[9-11]，低于此濃度則藥物不能發(fā)揮作用，與注射生理鹽水的作用無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。50 mg與75 mg劑量組相比，更大劑量可見效果與50 mg組作用相當(dāng)，還不能說明劑量增加后作用更強(qiáng)，2者相比沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡苁且?yàn)樗幬锉旧磉x擇的濃度范圍比較大，進(jìn)一步可適當(dāng)用不同劑量細(xì)分，深入探索藥物的量效關(guān)系，為臨床有效用藥積累實(shí)驗(yàn)資料。通過本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，雛菊葉龍膽50 mg、75 mg組在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的過程中，神經(jīng)遠(yuǎn)端的CNTF含量增高，提示在雛菊葉龍膽促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的過程中有CNTF局部釋放增加的過程，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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