3個野生毛花獼猴桃居群的SSR多樣性分析

楊妙賢， 潘偉明， 周玲艷， 劉 文,2， 葉嬋娟， 劉勝洪， 萬小榮， 梁 紅*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510225； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

獼猴桃是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物的總稱，為多年生雌雄異株落葉藤本植物.我國乃至世界上的獼猴桃主要栽培品種比較單一，狹窄的遺傳基礎(chǔ)帶來整個產(chǎn)業(yè)的脆弱性[1-3]，培育新的獼猴桃栽培品種已成為重點關(guān)注問題.目前，栽培獼猴桃主要是通過野生類型馴化和芽變枝條選優(yōu)擴繁而育成的，我國有著豐富的野生獼猴桃資源，自20世紀70年代以來，我國已從野生獼猴桃資源中選育出數(shù)百個品種和優(yōu)良株系[4-6].但隨著人口的迅速膨脹和經(jīng)濟活動的不斷加劇，森林面積的不斷減少，導(dǎo)致野生獼猴桃的原始生活環(huán)境遭到破壞，種質(zhì)資源流失嚴重.因此，對獼猴桃野生資源的遺傳多樣性研究，不僅對獼猴桃新品種的選育以及對種質(zhì)資源的收集和保存都有著極其重要的意義.

國內(nèi)外對獼猴桃的相關(guān)研究主要集中在資源圃的種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)與背景的評價[7-8]、獼猴桃屬植物的分子系統(tǒng)學(xué)研究[9-11]以及栽培品種(株系)的遺傳多樣性檢測與分子指紋鑒定等[12]，而對于獼猴桃野生居群的研究極少.微衛(wèi)星(micro satellite)DNA，即簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，是以1～6個堿基為基本單元的多次串聯(lián)重復(fù)序列.它們廣泛存在于各類真核生物基因組以及不同物種中，含量以及占優(yōu)勢的微衛(wèi)星序列類型各不相同，在基因組中表現(xiàn)出高度的長度多態(tài)性.在日益發(fā)展的眾多分子標記技術(shù)中，以其廣泛分布于基因組、共顯性、重現(xiàn)性好、多態(tài)性豐富等特點，廣泛應(yīng)用到植物分子生態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育與進化、種質(zhì)資源鑒定和評價等領(lǐng)域[13].毛花獼猴桃別名毛桃、毛陽桃、毛冬瓜，主要分布于廣東、廣西、江西、湖南、福建、貴州等海拔250 m以上的山區(qū)，耐濕、耐熱性很強且具有較高的營養(yǎng)價值，因此，其除果實具有育種利用價值外，還可用作中華獼猴桃和美味獼猴桃的耐濕、耐熱砧木，在我國南方具有較大的發(fā)展利用前景.本研究對野生毛花獼猴桃居群遺傳多樣性進行分析，可豐富獼猴桃野生資源的遺傳相關(guān)信息資源，為獼猴桃屬植物的種質(zhì)資源保育提供參考，同時也為獼猴桃的新品系選育、種質(zhì)資源保存、品種鑒定等各方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

從廣東省河源市和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石、上陵鎮(zhèn)桃源村及熱水鎮(zhèn)3個居群采集不同單株(每個居群41個樣本)的野生毛花獼猴桃葉片.采集的樣本用冰盒運回廣州后放入-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增

基因組DNA提取采用改良 SDS 法[14-15]，用9對穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的 SSR 引物[11](表1)進行擴增.擴增反應(yīng)體系為：DNA樣品0.5 μL(30 ng)，10×PCR buffer 2 μL，Mgcl2(25 mmol/L) 1.2 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，上游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，Taq 酶(0.5 U/ μL) 1 μL，ddH2O 15.6 μL.擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，55～57 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.擴增在Mastercycle Gradient PCR儀(Eppendorf Germany)上進行.擴增產(chǎn)物采用含7 mol/L尿素的6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測.

表1 SSR引物序列及其退火溫度Table 1 Primer sequences of SSR and their annealing temperatures

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)樣品電泳條帶的有無，在Excel表格上構(gòu)建0, 1矩陣圖，多態(tài)性位點百分比(Percentage of Polymorphic Band，簡稱PPB)按照下面公式計算：

多態(tài)性百分率(PPB)=多態(tài)性位點數(shù)量/總位點數(shù)量×100%.

等位位點頻率的計算方法參考等位基因的頻率計算方法[16]：等位位點頻率p=位點數(shù)量/總位點數(shù)量.計算出等位位點頻率后用PIC_Calc軟件計算位點的多態(tài)性信息量(Polymorphism Information Content, 簡稱PIC).

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

獼猴桃是多年生大型木質(zhì)藤本植物，幼葉中含有大量的多糖及膠類物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在會影響基因組DNA的提取效果，多糖污染的DNA呈粘稠膠狀，對反應(yīng)體系中的酶活性會產(chǎn)生抑制作用，最終影響PCR的效果.本實驗采用了NaAc-HAc高鹽低pH體系(pH 3.0～3.5)的DNA提取液，圖1的電泳圖譜中可見清晰的基因組DNA條帶，表明所提取的獼猴桃基因組DNA較完整，可用于PCR擴增.

1～17：不同居群的野生毛花獼猴桃

圖1 野生毛花獼猴桃基因組DNA的提取

Figure 1 Genomic DNA isolated from wildActinidiaerianthaBenth

2.2 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

選用9對SSR引物對3個野生毛花獼猴桃樣本DNA進行PCR擴增，所有樣品和引物擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后均獲得了清晰的圖譜(圖2～圖4)，說明所采用的SSR引物穩(wěn)定性好，適合獼猴桃的遺傳多態(tài)性分析.

圖2 引物UDK96-013對和平縣熱水鎮(zhèn)毛花獼猴桃樣本的擴增

Figure 2 SSR amplificates of wildActinidiaerianthaBenth from Reshui town, Heping county with primer UDK96-013

圖3 引物UDK96-019對和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石多花獼猴桃樣品的擴增

Figure 3 SSR amplificates of wildActinidiaerianthaBenth from Gaofeng and Yangshi in Shangling town, Heping county with primer UDK96-019

圖4 引物UDK96-009對和平縣上陵鎮(zhèn)桃源村毛花獼猴桃樣品的擴增

Figure 4 SSR amplificates of wildActinidiaerianthaBenth from Taoyuan village, Shangling town,Heping county with primer UDK96-009

2.3 不同居群毛花獼猴桃的多態(tài)性分析

按每個樣品電泳條帶的有無，將引物擴增的等位基因作為“l(fā)”或 “0” 賦值，構(gòu)建[0 1]數(shù)據(jù)矩陣作為分析數(shù)據(jù),再根據(jù)按 PIC計算公式，應(yīng)用PIC_Calc軟件計算其PIC值.結(jié)果表明，通過所選用的9對SSR引物對3個居群的獼猴桃樣本均擴增出多態(tài)性(圖2～圖4，表2).其中，9對引物在和平縣熱水鎮(zhèn)共10個樣品間共檢測到484個等位基因，平均每個多態(tài)性位點3.4個等位基因，9對引物多態(tài)信息量PIC值在0.661～0.951之間；和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石共22個樣品共檢測出881個等位基因, 平均每個多態(tài)性位點4.9個等位基因，9對引物多態(tài)信息量PIC值在0.670～0.949之間；上陵鎮(zhèn)桃源村共22個樣本共檢測出1 104個等位基因，平均每個多態(tài)性位點7.7個等位基因，9對引物多態(tài)信息量PIC值在0.560～0.916之間(表2).說明和平縣3個居群野生毛花獼猴桃具有極高的多態(tài)性.

表2 和平縣3個居群野生毛花獼猴桃SSR多樣性分析Table 2 SSR polymorphism analysis of wild Actinidia eriantha Benth from three populations in Heping county

多態(tài)性位點分析數(shù)據(jù)表明，9對SSR引物在和平縣熱水鎮(zhèn)樣本中共檢測出142個多態(tài)性位點，平均每對引物檢測出15.8個多態(tài)性位點，9對引物的平均多態(tài)性位點百分率為96.9%，平均PIC值為0.864；和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣本中共檢測出179個多態(tài)性位點，平均每對引物檢測出19.9個多態(tài)性位點，9對引物平均多態(tài)性百分率為97.2%，平均PIC值為0.880；和平縣上陵鎮(zhèn)桃源村樣本共檢測出144個多態(tài)性位點，平均每對引物檢測出16個多態(tài)性位點，9對引物的平均多態(tài)性位點百分率為96.9%，平均PIC值為0.845.其中平均多態(tài)性百分率最大的是和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣本，為97.2%，熱水鎮(zhèn)和上陵鎮(zhèn)桃源村兩地的樣品平均多態(tài)性百分率均為96.9%，與和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣品差距為0.3%；平均PIC值最大的為和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣本(0.880)，最小的上陵鎮(zhèn)桃源村樣本(0.845)，與和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣品差距為0.035(表2).說明3個居群的野生毛花獼猴桃的居群之間多態(tài)性差異不是很明顯，相對多態(tài)性較高的為和平縣上陵鎮(zhèn)高峰和羊石樣品，較低的為上陵鎮(zhèn)桃源村樣品.

3 討論

遺傳變異是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生變化而造成的一種可以遺傳給后代的變異.遺傳變異在居群內(nèi)的分布包括遺傳變異的大小、時空分布及其與環(huán)境之間的關(guān)系等.居群內(nèi)遺傳變異的分布體現(xiàn)了植物居群中的生態(tài)與進化過程[17].

獼猴桃屬的廣泛自然種間、種內(nèi)雜交，必然使其后代具有豐富的變異類型.栗琪等[18]對我國獼猴桃9個天然居群的遺傳多樣性進行的初步分析結(jié)果顯示，我國獼猴桃野生居群具有極高的遺傳多樣性，居群PIC值達0.87～0.96.劉亞令等[17]采用9對引物對中華獼猴桃和美味獼猴桃在2個居群中的168株樣本進行的多態(tài)性分析結(jié)果表明，中華獼猴桃居群PIC值平均達0.812，美味獼猴桃居群PIC值平均達0.83，也顯示出獼猴桃自然居群遺傳的多態(tài)性.毛花獼猴桃是雌雄異株，后代均為雌雄之間雜交產(chǎn)生，比較容易產(chǎn)生變異.

本研究通過9對SSR引物對3個居群的自然居群獼猴桃遺傳多樣性分析結(jié)果表明，3個居群的野生毛花獼猴桃均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性，平均PIC值均在0.845～0.880，說明從野生獼猴桃資源中選出的獼猴桃品種也具有高度遺傳多樣性.SSR多態(tài)性及其精確的片段大小與SSR 指紋圖譜相結(jié)合，便可建立每一品種的標準圖譜，迅速構(gòu)建我國獼猴桃品種的SSR 遺傳指紋圖譜，將為今后推廣優(yōu)良品種、調(diào)整獼猴桃產(chǎn)業(yè)的品種種植結(jié)構(gòu)、制定品種資源的保育策略以及新品種的登記注冊和產(chǎn)權(quán)保護奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)[19].同時對人工栽培種與野生種雜交選育新品系，豐富獼猴桃種質(zhì)資源也有著重要的指導(dǎo)意義，通過獼猴桃野生資源遺傳多態(tài)性的研究，結(jié)合親緣關(guān)系及遺傳變異的空間相關(guān)性研究，可以為獼猴桃野生種質(zhì)資源的保存，遺傳多樣性的保護提供指導(dǎo)，有助于獼猴桃物種保護工作的順利開展.

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