裸花紫珠試管苗生產(chǎn)技術(shù)初探

黃賽　潘梅　戚華莎　王景飛　呂德任

摘要：以帶腋芽的裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）嫩莖段為外植體，研究其組培快繁技術(shù)。結(jié)果表明，用0.1%的升汞處理外植體15 min， 接種于MS+1.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上，7 d后萌發(fā)腋芽；叢生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基增殖效果最佳，增殖系數(shù)達(dá)8.50；叢生芽的繼代培養(yǎng)周期是30 d，超出40 d時(shí)會(huì)有死株現(xiàn)象；培養(yǎng)基MS+0.5～0.8 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭+30 g/L蔗糖適宜誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)100%；生根苗移栽在V河沙∶V木屑∶V園土=1∶1∶1的混合基質(zhì)中，塑料薄膜保濕20 d成活率達(dá)93%，且植株生長良好。

關(guān)鍵詞：裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）；試管苗；莖段；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S567.1+9；Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）13-3121-03

Production Technologies of Callicarpa nudiflora Hook. et Arn. Test-Tube Plantlets

HUANG Sai，PAN Mei，QI Hua-sha，WANG Jing-fei，L？譈 De-ren

（Institute of Horticulture and Flower， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， China）

Abstract： Using tender stem segments of Callicarpa nudiflora as explants， the techniques of tissue culture and rapid propagation in vitro were studied. Results showed that the optimum disinfector was 0.1% HgCl2 for 15 min， with MS+6-BA1.5 mg/L+ sucrose 30 g/L as the initial medium. After inoculation for 7 d， the axillaries buds began to germinate. Using MS+6-BA 2.0 mg/L + sucrose 30 g/L as the proliferation medium， the proliferation multiples reached 8.50. The best cycle of subculture training was 30 d. The plantlets would appear dead when more than 40 d. The rooting culture medium was MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+ active carbon 0.5 g/L + sucrose 30 g/L，with the best rooting effect and the rate of rooting of 100%. When the rooted seedlings were transplanted into the mediums of sand∶soil∶sawdust（1∶1∶1） and covered with plastic film for keeping moisture for 20 d， the survival rate reached up to 93%.

Key words： Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.； test-tube plantlet； stem segment； tissue culture

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）為馬鞭草科紫珠屬植物，是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一。分布在海南的定安、儋州、澄邁、白沙、昌江、東方、三亞、陵水、保亭、瓊中等地，尤其產(chǎn)于五指山的為上品[1]。具有抗菌、止血、散瘀消腫之功效，主治各種炎癥、外傷出血、跌打腫痛、風(fēng)濕腫痛、肺結(jié)核咳血、胃腸出血等癥[2，3]。隨著南藥開發(fā)利用的不斷深入，裸花紫珠的市場需求量不斷增大，但供應(yīng)渠道仍以野生采伐為主，不僅不能滿足市場的需求，而且還導(dǎo)致了嚴(yán)重的生態(tài)問題。由于裸花紫珠的人工常規(guī)育種能力低，難于進(jìn)行大規(guī)模繁殖育種，直接影響其種植生產(chǎn)。目前國內(nèi)研究報(bào)道側(cè)重在藥理分析、治療效果等方面[4-7]，在組織培養(yǎng)方面較少[8，9]，因此，裸花紫珠試管苗生產(chǎn)技術(shù)研究在生產(chǎn)中具有重要的推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

裸花紫珠嫩莖段采自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理 選取帶腋芽的裸花紫珠嫩莖段，在自來水下沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精浸泡10 s，再轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒15 min，用無菌水沖洗5次后對(duì)其進(jìn)行切割接種。切割時(shí)，切去與升汞接觸到的切口，接種于MS+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中。為避免交叉感染，每袋只接種一個(gè)腋芽莖段。

1.2.2 培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，在不同階段的培養(yǎng)基中分別添加不同的激素。所有培養(yǎng)基均含有30 g/L蔗糖（蔗糖濃度比較試驗(yàn)除外），7 g/L的卡拉膠，pH 5.8。分裝的培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃，0.14 MPa滅菌20 min[10]。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（26±2） ℃，光照度1 100～1 500 lx，光照時(shí)間9 h/d。

1.2.4 移栽基質(zhì) 移栽基質(zhì)采用V河沙∶V珍珠巖：V園土=1∶1∶1混合而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸花紫珠無菌材料的獲得和芽的誘導(dǎo)

接種后外植體開始分泌褐色物質(zhì)，3 d后培養(yǎng)基開始呈現(xiàn)褐色，10 d左右培養(yǎng)基褐色加深，在7 d左右開始萌發(fā)腋芽。萌發(fā)出的腋芽即可用解剖刀切取，轉(zhuǎn)入相同的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。周而復(fù)始，可獲得較大數(shù)量的叢生芽。

2.2 裸花紫珠叢生芽的增殖

2.2.1 不同細(xì)胞分裂素對(duì)裸花紫珠叢生芽誘導(dǎo)的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的細(xì)胞分裂素，以MS為基本培養(yǎng)基，以濃度均為2.0 mg/L的6-BA、KT、ZT、TDZ 4種處理進(jìn)行比較試驗(yàn)，接種30 d后的觀察結(jié)果見表1。從表1可以看出，6-BA對(duì)裸花紫珠增殖培養(yǎng)效果最好，增殖系數(shù)最大，達(dá)8.50，叢芽的長勢好，芽苗健壯，色綠，整齊，分化多，苗高2～3 cm；其次為TDZ，增殖系數(shù)為5.62，分化芽較多，但芽苗黃，節(jié)短，莖基部膨大少許，死株較多；添加KT的增殖系數(shù)為3.22，長勢一般，節(jié)較密，少數(shù)株死亡，苗高1.0～1.8 cm；表現(xiàn)最差的是ZT，增殖系數(shù)僅為2.88，長勢較好，葉片較大，節(jié)間長，分化不整齊，苗高1～4 cm。因此，裸花紫珠增殖培養(yǎng)選用細(xì)胞分裂素6-BA較合適。

2.2.2 不同濃度6-BA對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的6-BA濃度，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L 9個(gè)濃度梯度進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，6-BA濃度在0～2 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的升高而升高。當(dāng)6-BA濃度大于2 mg/L時(shí)，反而抑制了叢生芽的增殖生長，隨著6-BA濃度的增大，增殖系數(shù)越來越小。從叢生芽的生長狀況來看，0、0.5、1.0、1.5 mg/L處理的叢生芽植株生長較細(xì)，株高1～2 cm；3.0～4.0 mg/L處理的叢生芽植株也細(xì)，株高1.0～1.5 cm，且還出現(xiàn)了不同程度的玻璃化苗；2.0 mg/L處理的叢生芽植株生長健壯，株高2.0～2.5 cm；2.5 mg/L處理的叢生芽植株高2.0～2.5 cm，但沒有2.0 mg/L處理的健壯。因此，從增殖系數(shù)和叢生芽的生長情況來看，培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA對(duì)叢生芽的增殖效果最好。

2.2.3 不同濃度蔗糖對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的蔗糖濃度，設(shè)計(jì)MS+2.0 mg/L 6-BA+蔗糖（濃度為0、20、30、40 g/L）4種處理培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，蔗糖濃度30 g/L時(shí)有利于叢生芽的增殖，增殖系數(shù)最大，叢生芽生長的長勢好，葉片平展，健壯，色綠，整齊。蔗糖濃度過高或過低均不利于叢生芽的增殖生長。在蔗糖濃度0～20 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)低，芽苗長勢差，分化不整齊；在蔗糖濃度40 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)較低，芽苗葉片彎曲，莖尖葉片變小，因此裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)的適宜蔗糖濃度為30 g/L。

2.2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出裸花紫珠繼代增殖最佳轉(zhuǎn)瓶時(shí)間，將叢生芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，總共接種120袋，每袋放置3塊叢芽，放入同層培養(yǎng)架上培養(yǎng)。在培養(yǎng)20、25、30、35、40 d時(shí)，每次隨機(jī)抽取7袋，分別求其增殖系數(shù)，觀察生長情況進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。表4結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間在20～30 d時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延后，叢生芽的增殖系數(shù)加大，芽苗增高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到35 d時(shí)，增殖系數(shù)下降，芽苗不再長高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過40 d時(shí)，芽苗出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)周期為30 d。

2.3 裸花紫珠生根培養(yǎng)

為了篩選出裸花紫珠試管苗生根培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基， 附加0.5 g/L活性炭，設(shè)置NAA 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L共6個(gè)處理， 將高2 cm的小苗轉(zhuǎn)入上述生根培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種20袋，每袋接種8株，30 d后觀察生根情況，結(jié)果見表5。從表5可見，在添加NAA濃度小于0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因NAA濃度的升高而增加。當(dāng)NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，平均生根條數(shù)最多，達(dá)到12條，平均根長最長，為1.65 cm。在添加NAA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因濃度的升高而降低。從平均株高和生根率來看，NAA濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，生根率都達(dá)到100%。從生長狀況來看，NAA濃度過高或過低都不利于根系的生長，當(dāng)濃度過高時(shí)，根基會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，發(fā)根少、短；當(dāng)濃度過低時(shí)，發(fā)根少、細(xì)長。當(dāng)NAA 濃度為0.5～0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠發(fā)根多、粗壯。因此，培養(yǎng)基MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適于裸花紫珠生根培養(yǎng)。

2.4 試管苗的煉苗移栽

由于組培苗一直生長在相對(duì)恒定的溫度、光照環(huán)境中，對(duì)外界多變的自然環(huán)境一時(shí)難以適應(yīng)，移栽前要經(jīng)過一個(gè)充足煉苗的過程才能提高移栽成活率。裸花紫珠煉苗是取根系發(fā)達(dá)、株高達(dá)3 cm的生根苗，移置陰棚里培養(yǎng)20 d左右。移栽前要洗凈根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽到V河沙∶V木屑∶V園土=1∶1∶1混合基質(zhì)中，淋足定根水，蓋塑料薄膜保濕20 d。試管苗移栽40 d后即可成活，其成活率可達(dá)93%。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)中在培養(yǎng)初期出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，但有腋芽萌發(fā)時(shí)這種現(xiàn)象就大大減輕了?？赡苁敲劝l(fā)的腋芽處于旺盛的生長狀態(tài)，其分生能力強(qiáng)的類型細(xì)胞大量增殖，酚類物質(zhì)被氧化受到抑制的緣故[11]。因此，認(rèn)為在裸花紫珠嫩莖段消毒時(shí)只要嚴(yán)格控制消毒液濃度和消毒時(shí)間，就能有效控制材料的褐化。裸花紫珠嫩莖滅菌比較困難， 因?yàn)槁慊ㄗ现槟矍o表面有絨毛，用0.1%升汞消毒 15 min可獲得無菌材料，無菌材料在MS+1.5 mg/L 6-BA上7 d后可以抽出新芽，新芽在同樣的培養(yǎng)基上易形成叢生芽。裸花紫珠增殖適宜的細(xì)胞分裂素是6-BA，它是芽苗增殖擴(kuò)繁的關(guān)鍵，適宜的濃度2.0 mg/L對(duì)芽苗增殖生長起促進(jìn)作用。6-BA濃度過高或過低，芽苗長勢細(xì)弱，增殖系數(shù)低。當(dāng)6-BA濃度達(dá)到3 mg/L時(shí)出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象。同時(shí)叢生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA上增殖培養(yǎng)最適的蔗糖濃度是30 g/L，濃度過高或過低都會(huì)影響增殖效果。此外，叢生芽在培養(yǎng)30 d時(shí)，叢芽的生長量最大，增殖系數(shù)最高，為8.19，是轉(zhuǎn)瓶的最佳時(shí)間。研究表明培養(yǎng)基MS+ NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適宜誘導(dǎo)裸花紫珠生根，生根率達(dá)100%，根系質(zhì)量好，而NAA濃度達(dá)到1 mg/L會(huì)產(chǎn)生雞爪根。裸花紫珠組培苗對(duì)移栽基質(zhì)與環(huán)境要求高，在加蓋塑料薄膜保濕的環(huán)境中，裸花紫珠移栽在基質(zhì)河沙：園土：木屑體積比為1∶1∶1時(shí)表現(xiàn)最好，成活率最高，達(dá)93%，新長出的葉大而綠，莖粗葉茂，植株健壯，根系發(fā)達(dá)粗壯。

試驗(yàn)以裸花紫珠的帶節(jié)莖段作為接種材料， 通過芽生芽的方式進(jìn)行快速繁殖，有利于保持原植物的優(yōu)良遺傳特性及有效成分，為該藥用植物的繁殖提供了新的途徑[12]。

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1.2.4 移栽基質(zhì) 移栽基質(zhì)采用V河沙∶V珍珠巖：V園土=1∶1∶1混合而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸花紫珠無菌材料的獲得和芽的誘導(dǎo)

接種后外植體開始分泌褐色物質(zhì)，3 d后培養(yǎng)基開始呈現(xiàn)褐色，10 d左右培養(yǎng)基褐色加深，在7 d左右開始萌發(fā)腋芽。萌發(fā)出的腋芽即可用解剖刀切取，轉(zhuǎn)入相同的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。周而復(fù)始，可獲得較大數(shù)量的叢生芽。

2.2 裸花紫珠叢生芽的增殖

2.2.1 不同細(xì)胞分裂素對(duì)裸花紫珠叢生芽誘導(dǎo)的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的細(xì)胞分裂素，以MS為基本培養(yǎng)基，以濃度均為2.0 mg/L的6-BA、KT、ZT、TDZ 4種處理進(jìn)行比較試驗(yàn)，接種30 d后的觀察結(jié)果見表1。從表1可以看出，6-BA對(duì)裸花紫珠增殖培養(yǎng)效果最好，增殖系數(shù)最大，達(dá)8.50，叢芽的長勢好，芽苗健壯，色綠，整齊，分化多，苗高2～3 cm；其次為TDZ，增殖系數(shù)為5.62，分化芽較多，但芽苗黃，節(jié)短，莖基部膨大少許，死株較多；添加KT的增殖系數(shù)為3.22，長勢一般，節(jié)較密，少數(shù)株死亡，苗高1.0～1.8 cm；表現(xiàn)最差的是ZT，增殖系數(shù)僅為2.88，長勢較好，葉片較大，節(jié)間長，分化不整齊，苗高1～4 cm。因此，裸花紫珠增殖培養(yǎng)選用細(xì)胞分裂素6-BA較合適。

2.2.2 不同濃度6-BA對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的6-BA濃度，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L 9個(gè)濃度梯度進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，6-BA濃度在0～2 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的升高而升高。當(dāng)6-BA濃度大于2 mg/L時(shí)，反而抑制了叢生芽的增殖生長，隨著6-BA濃度的增大，增殖系數(shù)越來越小。從叢生芽的生長狀況來看，0、0.5、1.0、1.5 mg/L處理的叢生芽植株生長較細(xì)，株高1～2 cm；3.0～4.0 mg/L處理的叢生芽植株也細(xì)，株高1.0～1.5 cm，且還出現(xiàn)了不同程度的玻璃化苗；2.0 mg/L處理的叢生芽植株生長健壯，株高2.0～2.5 cm；2.5 mg/L處理的叢生芽植株高2.0～2.5 cm，但沒有2.0 mg/L處理的健壯。因此，從增殖系數(shù)和叢生芽的生長情況來看，培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA對(duì)叢生芽的增殖效果最好。

2.2.3 不同濃度蔗糖對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的蔗糖濃度，設(shè)計(jì)MS+2.0 mg/L 6-BA+蔗糖（濃度為0、20、30、40 g/L）4種處理培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，蔗糖濃度30 g/L時(shí)有利于叢生芽的增殖，增殖系數(shù)最大，叢生芽生長的長勢好，葉片平展，健壯，色綠，整齊。蔗糖濃度過高或過低均不利于叢生芽的增殖生長。在蔗糖濃度0～20 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)低，芽苗長勢差，分化不整齊；在蔗糖濃度40 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)較低，芽苗葉片彎曲，莖尖葉片變小，因此裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)的適宜蔗糖濃度為30 g/L。

2.2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出裸花紫珠繼代增殖最佳轉(zhuǎn)瓶時(shí)間，將叢生芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，總共接種120袋，每袋放置3塊叢芽，放入同層培養(yǎng)架上培養(yǎng)。在培養(yǎng)20、25、30、35、40 d時(shí)，每次隨機(jī)抽取7袋，分別求其增殖系數(shù)，觀察生長情況進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。表4結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間在20～30 d時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延后，叢生芽的增殖系數(shù)加大，芽苗增高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到35 d時(shí)，增殖系數(shù)下降，芽苗不再長高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過40 d時(shí)，芽苗出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)周期為30 d。

2.3 裸花紫珠生根培養(yǎng)

為了篩選出裸花紫珠試管苗生根培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基， 附加0.5 g/L活性炭，設(shè)置NAA 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L共6個(gè)處理， 將高2 cm的小苗轉(zhuǎn)入上述生根培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種20袋，每袋接種8株，30 d后觀察生根情況，結(jié)果見表5。從表5可見，在添加NAA濃度小于0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因NAA濃度的升高而增加。當(dāng)NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，平均生根條數(shù)最多，達(dá)到12條，平均根長最長，為1.65 cm。在添加NAA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因濃度的升高而降低。從平均株高和生根率來看，NAA濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，生根率都達(dá)到100%。從生長狀況來看，NAA濃度過高或過低都不利于根系的生長，當(dāng)濃度過高時(shí)，根基會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，發(fā)根少、短；當(dāng)濃度過低時(shí)，發(fā)根少、細(xì)長。當(dāng)NAA 濃度為0.5～0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠發(fā)根多、粗壯。因此，培養(yǎng)基MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適于裸花紫珠生根培養(yǎng)。

2.4 試管苗的煉苗移栽

由于組培苗一直生長在相對(duì)恒定的溫度、光照環(huán)境中，對(duì)外界多變的自然環(huán)境一時(shí)難以適應(yīng)，移栽前要經(jīng)過一個(gè)充足煉苗的過程才能提高移栽成活率。裸花紫珠煉苗是取根系發(fā)達(dá)、株高達(dá)3 cm的生根苗，移置陰棚里培養(yǎng)20 d左右。移栽前要洗凈根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽到V河沙∶V木屑∶V園土=1∶1∶1混合基質(zhì)中，淋足定根水，蓋塑料薄膜保濕20 d。試管苗移栽40 d后即可成活，其成活率可達(dá)93%。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)中在培養(yǎng)初期出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，但有腋芽萌發(fā)時(shí)這種現(xiàn)象就大大減輕了?？赡苁敲劝l(fā)的腋芽處于旺盛的生長狀態(tài)，其分生能力強(qiáng)的類型細(xì)胞大量增殖，酚類物質(zhì)被氧化受到抑制的緣故[11]。因此，認(rèn)為在裸花紫珠嫩莖段消毒時(shí)只要嚴(yán)格控制消毒液濃度和消毒時(shí)間，就能有效控制材料的褐化。裸花紫珠嫩莖滅菌比較困難， 因?yàn)槁慊ㄗ现槟矍o表面有絨毛，用0.1%升汞消毒 15 min可獲得無菌材料，無菌材料在MS+1.5 mg/L 6-BA上7 d后可以抽出新芽，新芽在同樣的培養(yǎng)基上易形成叢生芽。裸花紫珠增殖適宜的細(xì)胞分裂素是6-BA，它是芽苗增殖擴(kuò)繁的關(guān)鍵，適宜的濃度2.0 mg/L對(duì)芽苗增殖生長起促進(jìn)作用。6-BA濃度過高或過低，芽苗長勢細(xì)弱，增殖系數(shù)低。當(dāng)6-BA濃度達(dá)到3 mg/L時(shí)出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象。同時(shí)叢生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA上增殖培養(yǎng)最適的蔗糖濃度是30 g/L，濃度過高或過低都會(huì)影響增殖效果。此外，叢生芽在培養(yǎng)30 d時(shí)，叢芽的生長量最大，增殖系數(shù)最高，為8.19，是轉(zhuǎn)瓶的最佳時(shí)間。研究表明培養(yǎng)基MS+ NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適宜誘導(dǎo)裸花紫珠生根，生根率達(dá)100%，根系質(zhì)量好，而NAA濃度達(dá)到1 mg/L會(huì)產(chǎn)生雞爪根。裸花紫珠組培苗對(duì)移栽基質(zhì)與環(huán)境要求高，在加蓋塑料薄膜保濕的環(huán)境中，裸花紫珠移栽在基質(zhì)河沙：園土：木屑體積比為1∶1∶1時(shí)表現(xiàn)最好，成活率最高，達(dá)93%，新長出的葉大而綠，莖粗葉茂，植株健壯，根系發(fā)達(dá)粗壯。

試驗(yàn)以裸花紫珠的帶節(jié)莖段作為接種材料， 通過芽生芽的方式進(jìn)行快速繁殖，有利于保持原植物的優(yōu)良遺傳特性及有效成分，為該藥用植物的繁殖提供了新的途徑[12]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡金平，董 琳，關(guān)薇薇，等.裸花紫珠的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27（1）：60-64.

[2] 劉明生.黎藥學(xué)概論[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[3] 董 琳，劉明生，王金輝，等.黎藥-裸花紫珠氯仿萃取部位的化學(xué)成分[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（31）：21-22.

[4] 王祝年，韓 壯，崔海濱，等.裸花紫珠的化學(xué)成分[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2007，15（4）：359-362.

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[9] 潘 梅，黃 賽，王景飛，等.藥用植物裸花紫珠的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（7）：127-132.

[10] 曹孜義，劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1995.

[11] 冉懋雄.中藥組織培養(yǎng)實(shí)用技術(shù)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2004.

[12] 毛堂芬，朱 英.藥用植物頭花蓼的組織培養(yǎng)快速繁殖[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（5）：16-17

1.2.4 移栽基質(zhì) 移栽基質(zhì)采用V河沙∶V珍珠巖：V園土=1∶1∶1混合而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸花紫珠無菌材料的獲得和芽的誘導(dǎo)

接種后外植體開始分泌褐色物質(zhì)，3 d后培養(yǎng)基開始呈現(xiàn)褐色，10 d左右培養(yǎng)基褐色加深，在7 d左右開始萌發(fā)腋芽。萌發(fā)出的腋芽即可用解剖刀切取，轉(zhuǎn)入相同的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。周而復(fù)始，可獲得較大數(shù)量的叢生芽。

2.2 裸花紫珠叢生芽的增殖

2.2.1 不同細(xì)胞分裂素對(duì)裸花紫珠叢生芽誘導(dǎo)的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的細(xì)胞分裂素，以MS為基本培養(yǎng)基，以濃度均為2.0 mg/L的6-BA、KT、ZT、TDZ 4種處理進(jìn)行比較試驗(yàn)，接種30 d后的觀察結(jié)果見表1。從表1可以看出，6-BA對(duì)裸花紫珠增殖培養(yǎng)效果最好，增殖系數(shù)最大，達(dá)8.50，叢芽的長勢好，芽苗健壯，色綠，整齊，分化多，苗高2～3 cm；其次為TDZ，增殖系數(shù)為5.62，分化芽較多，但芽苗黃，節(jié)短，莖基部膨大少許，死株較多；添加KT的增殖系數(shù)為3.22，長勢一般，節(jié)較密，少數(shù)株死亡，苗高1.0～1.8 cm；表現(xiàn)最差的是ZT，增殖系數(shù)僅為2.88，長勢較好，葉片較大，節(jié)間長，分化不整齊，苗高1～4 cm。因此，裸花紫珠增殖培養(yǎng)選用細(xì)胞分裂素6-BA較合適。

2.2.2 不同濃度6-BA對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的6-BA濃度，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L 9個(gè)濃度梯度進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，6-BA濃度在0～2 mg/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的升高而升高。當(dāng)6-BA濃度大于2 mg/L時(shí)，反而抑制了叢生芽的增殖生長，隨著6-BA濃度的增大，增殖系數(shù)越來越小。從叢生芽的生長狀況來看，0、0.5、1.0、1.5 mg/L處理的叢生芽植株生長較細(xì)，株高1～2 cm；3.0～4.0 mg/L處理的叢生芽植株也細(xì)，株高1.0～1.5 cm，且還出現(xiàn)了不同程度的玻璃化苗；2.0 mg/L處理的叢生芽植株生長健壯，株高2.0～2.5 cm；2.5 mg/L處理的叢生芽植株高2.0～2.5 cm，但沒有2.0 mg/L處理的健壯。因此，從增殖系數(shù)和叢生芽的生長情況來看，培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA對(duì)叢生芽的增殖效果最好。

2.2.3 不同濃度蔗糖對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出較適宜裸花紫珠增殖的蔗糖濃度，設(shè)計(jì)MS+2.0 mg/L 6-BA+蔗糖（濃度為0、20、30、40 g/L）4種處理培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)，30 d后觀察叢生芽的增殖情況，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，蔗糖濃度30 g/L時(shí)有利于叢生芽的增殖，增殖系數(shù)最大，叢生芽生長的長勢好，葉片平展，健壯，色綠，整齊。蔗糖濃度過高或過低均不利于叢生芽的增殖生長。在蔗糖濃度0～20 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)低，芽苗長勢差，分化不整齊；在蔗糖濃度40 g/L時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)較低，芽苗葉片彎曲，莖尖葉片變小，因此裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)的適宜蔗糖濃度為30 g/L。

2.2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)裸花紫珠叢生芽增殖的影響 為了篩選出裸花紫珠繼代增殖最佳轉(zhuǎn)瓶時(shí)間，將叢生芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，總共接種120袋，每袋放置3塊叢芽，放入同層培養(yǎng)架上培養(yǎng)。在培養(yǎng)20、25、30、35、40 d時(shí)，每次隨機(jī)抽取7袋，分別求其增殖系數(shù)，觀察生長情況進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。表4結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間在20～30 d時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延后，叢生芽的增殖系數(shù)加大，芽苗增高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到35 d時(shí)，增殖系數(shù)下降，芽苗不再長高；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過40 d時(shí)，芽苗出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，裸花紫珠叢生芽繼代增殖培養(yǎng)周期為30 d。

2.3 裸花紫珠生根培養(yǎng)

為了篩選出裸花紫珠試管苗生根培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基， 附加0.5 g/L活性炭，設(shè)置NAA 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L共6個(gè)處理， 將高2 cm的小苗轉(zhuǎn)入上述生根培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種20袋，每袋接種8株，30 d后觀察生根情況，結(jié)果見表5。從表5可見，在添加NAA濃度小于0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因NAA濃度的升高而增加。當(dāng)NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，平均生根條數(shù)最多，達(dá)到12條，平均根長最長，為1.65 cm。在添加NAA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，裸花紫珠的平均生根條數(shù)和平均根長會(huì)因濃度的升高而降低。從平均株高和生根率來看，NAA濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，生根率都達(dá)到100%。從生長狀況來看，NAA濃度過高或過低都不利于根系的生長，當(dāng)濃度過高時(shí)，根基會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，發(fā)根少、短；當(dāng)濃度過低時(shí)，發(fā)根少、細(xì)長。當(dāng)NAA 濃度為0.5～0.8 mg/L時(shí)，裸花紫珠發(fā)根多、粗壯。因此，培養(yǎng)基MS+NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適于裸花紫珠生根培養(yǎng)。

2.4 試管苗的煉苗移栽

由于組培苗一直生長在相對(duì)恒定的溫度、光照環(huán)境中，對(duì)外界多變的自然環(huán)境一時(shí)難以適應(yīng)，移栽前要經(jīng)過一個(gè)充足煉苗的過程才能提高移栽成活率。裸花紫珠煉苗是取根系發(fā)達(dá)、株高達(dá)3 cm的生根苗，移置陰棚里培養(yǎng)20 d左右。移栽前要洗凈根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽到V河沙∶V木屑∶V園土=1∶1∶1混合基質(zhì)中，淋足定根水，蓋塑料薄膜保濕20 d。試管苗移栽40 d后即可成活，其成活率可達(dá)93%。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)中在培養(yǎng)初期出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，但有腋芽萌發(fā)時(shí)這種現(xiàn)象就大大減輕了。可能是萌發(fā)的腋芽處于旺盛的生長狀態(tài)，其分生能力強(qiáng)的類型細(xì)胞大量增殖，酚類物質(zhì)被氧化受到抑制的緣故[11]。因此，認(rèn)為在裸花紫珠嫩莖段消毒時(shí)只要嚴(yán)格控制消毒液濃度和消毒時(shí)間，就能有效控制材料的褐化。裸花紫珠嫩莖滅菌比較困難， 因?yàn)槁慊ㄗ现槟矍o表面有絨毛，用0.1%升汞消毒 15 min可獲得無菌材料，無菌材料在MS+1.5 mg/L 6-BA上7 d后可以抽出新芽，新芽在同樣的培養(yǎng)基上易形成叢生芽。裸花紫珠增殖適宜的細(xì)胞分裂素是6-BA，它是芽苗增殖擴(kuò)繁的關(guān)鍵，適宜的濃度2.0 mg/L對(duì)芽苗增殖生長起促進(jìn)作用。6-BA濃度過高或過低，芽苗長勢細(xì)弱，增殖系數(shù)低。當(dāng)6-BA濃度達(dá)到3 mg/L時(shí)出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象。同時(shí)叢生芽在MS+2.0 mg/L 6-BA上增殖培養(yǎng)最適的蔗糖濃度是30 g/L，濃度過高或過低都會(huì)影響增殖效果。此外，叢生芽在培養(yǎng)30 d時(shí)，叢芽的生長量最大，增殖系數(shù)最高，為8.19，是轉(zhuǎn)瓶的最佳時(shí)間。研究表明培養(yǎng)基MS+ NAA 0.5～0.8 mg/L+0.5 g/L活性炭適宜誘導(dǎo)裸花紫珠生根，生根率達(dá)100%，根系質(zhì)量好，而NAA濃度達(dá)到1 mg/L會(huì)產(chǎn)生雞爪根。裸花紫珠組培苗對(duì)移栽基質(zhì)與環(huán)境要求高，在加蓋塑料薄膜保濕的環(huán)境中，裸花紫珠移栽在基質(zhì)河沙：園土：木屑體積比為1∶1∶1時(shí)表現(xiàn)最好，成活率最高，達(dá)93%，新長出的葉大而綠，莖粗葉茂，植株健壯，根系發(fā)達(dá)粗壯。

試驗(yàn)以裸花紫珠的帶節(jié)莖段作為接種材料， 通過芽生芽的方式進(jìn)行快速繁殖，有利于保持原植物的優(yōu)良遺傳特性及有效成分，為該藥用植物的繁殖提供了新的途徑[12]。

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