高壓氧輔助干細(xì)胞治療心肌梗死大鼠后心功能效應(yīng)性研究1）

王彥青，張 紅

干細(xì)胞移植能保護(hù)甚至修復(fù)梗死心臟的收縮功能，但是臨床試驗(yàn)薈萃結(jié)果顯示[1]，移植效果不理想，大部分移植細(xì)胞不能在受損組織中長(zhǎng)期存活[2]。心肌梗死早期，體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，局部惡劣的缺血缺氧性微環(huán)境是移植干細(xì)胞在心肌受損組織大量死亡的根本原因[3]。目前臨床上基于高壓氧能夠激發(fā)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕全身及局部的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能，改善細(xì)胞的有氧代謝，而廣泛應(yīng)用于改善腦、脊髓及組織缺血缺氧性治療。本研究觀察高壓氧輔助人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植心肌梗死大鼠后干細(xì)胞的存活增殖、心肌細(xì)胞分化及心臟功能改善情況，以明確高壓氧是否能夠改善移植干細(xì)胞治療大鼠心肌梗死的治療效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康清潔雄性SD大鼠（體重250g～300 g），購(gòu)自寧波大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。利用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)化分組，分為假手術(shù)組（20只）、心肌梗死（AMI）組（20只）、干細(xì)胞（MSCs）組（15只）、高壓氧（HBO）組（15只）、干細(xì)胞組移植＋高壓氧（MSCs＋HBO組15只），每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均為5只。

1.2 人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 新生兒臍帶由我院婦產(chǎn)科提供（胎齡37周～40周），采用Ⅱ型膠原酶（Gibco公司，美國(guó)）消化法提取華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁法無菌培養(yǎng)至三代，用肝素鹽水（濃度為62.5U／mL）洗滌3遍重懸細(xì)胞配制成干細(xì)胞懸液（10～15）mL，細(xì)胞數(shù)（6±0.3）×105，活細(xì)胞比例98%。留置Edu標(biāo)記。

1.3 人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞Edu標(biāo)記 嚴(yán)格按Edu染色試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司，RN：R11053.2）說明進(jìn)行，用細(xì)胞培養(yǎng)基按1 000∶1稀釋Edu溶液（廣州銳博生物科技有限公司，RN：R11053.2），制備適量50μM Edu培養(yǎng)基，加入干細(xì)胞懸液孵育2h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞（1～2）次，每次5min，留置移植備用。

1.4 大鼠心肌梗死模型的建立及細(xì)胞移植 參照文獻(xiàn)方法[4]，復(fù)制急性心肌梗死大鼠動(dòng)物模型。假手術(shù)組大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支穿線但未進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)，其余操作同模型組。于心肌梗死模型建立后第3天，大鼠二次開胸，可見梗死區(qū)心肌顏色稍白，將Edu標(biāo)記的人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)（6±0.3）×105，沿梗死心肌周邊0.5cm區(qū)域內(nèi)，4個(gè)點(diǎn)自心外膜心肌注射，每點(diǎn)0.1mL，注射深度2mm左右，關(guān)胸。

1.5 高壓氧治療 心肌梗死模型建立后1d～30d，每日以0.2ATA／min注入純氧，至壓力達(dá)到2.0ATA。當(dāng)壓力穩(wěn)定后，將大鼠放置60min。達(dá)到規(guī)定時(shí)間以0.2ATA／min排放艙內(nèi)氧氣，至艙內(nèi)壓力恢復(fù)至正常。

1.6 心臟組織標(biāo)本留取 大鼠麻醉狀態(tài)下，心腔內(nèi)注射10%KCl溶液1mL，使心臟停于舒張期，迅速取出心臟，垂直心臟長(zhǎng)軸將其平分3段，每段心肌部分置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，垂直心臟長(zhǎng)軸連續(xù)切片，厚度4μm，留置免疫熒光檢測(cè)。

1.7 移植細(xì)胞存活及繁殖情況 從每個(gè)心臟標(biāo)本上、中、下3段中取4μm石蠟切片，嚴(yán)格按edu試劑盒說明（廣州銳博生物科技有限公司）進(jìn)行edu免疫熒光檢測(cè)，染色后采用共聚焦顯微鏡（TCS－SP5型，Leiea公司，德國(guó)）觀察，分別用555nm 激發(fā)EdU－Apollo?567和350nm激發(fā)Hoechst 33342熒光染料，并采用Image－Pro plus 6.0軟件進(jìn)行細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)分析，依據(jù)細(xì)胞增殖率＝增殖細(xì)胞數(shù)（紅色（EdU－Apollo?567））／細(xì)胞總數(shù)×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.8 心肌肌鈣蛋白表達(dá)檢測(cè) 進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色，心臟石蠟切片，脫蠟，2mg／mL甘氨酸清洗10min，加入100μL滲透劑（0.5%Triton X－100的PBS）脫色搖床孵育10min，PBS清洗加入100μL的1XApollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液。分別滴加1∶1 000稀釋兔抗鼠心肌Tn－T作為一抗4℃過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。分別同時(shí)加入100μL 1XHoechst 33342染色反應(yīng)液、異硫氰酸熒光素標(biāo)山羊抗兔IgG，避光，室溫孵育45min后，棄染色反應(yīng)液。PBS清洗3次，洗脫反應(yīng)液。染色后采用共聚焦顯微鏡（TCS－SP5型，Leiea公司，德國(guó)）觀察，分別用555nm激發(fā)EdU－Apollo?567和350nm 激發(fā) Hoechst 33342熒光染料，并采用Image－Pro plus 6.0軟件進(jìn)行。

1.9 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)及功能 評(píng)價(jià)指標(biāo)包括左室舒張末期容積（LVSV）、收縮末容積（LVDV）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）及每搏輸出量（SV）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0軟件分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用成組資料的t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及Edu標(biāo)記情況 人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在接種后2h開始貼壁，3d開始分散存在的細(xì)胞克隆，呈長(zhǎng)梭形，10d細(xì)胞集落達(dá)90%融合，消化傳代的細(xì)胞于24h貼壁，呈漩渦狀或平行狀排列，平均3d再次傳代，3代以后的干細(xì)胞純度達(dá)95%。Edu染色結(jié)果顯示，第三代干細(xì)胞增殖能力接近100%。

2.2 移植細(xì)胞存活及增殖情況 干細(xì)胞移植后第4周，高壓氧＋干細(xì)胞組與干細(xì)胞組比較，心肌組織局部干細(xì)胞存活增殖率顯著增高（276.6±73.8vs 20.5±12.3，P＜0.01）。

2.3 心肌細(xì)胞肌鈣蛋白T表達(dá)情況 干細(xì)胞移植后第4周，高壓氧＋干細(xì)胞組與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞在心肌組織局部肌鈣蛋白表達(dá)顯示增加。

2.4 干細(xì)胞移植后第4周各組心功能狀況 與正常大鼠相比，心肌梗死后第4周，舒張末容積及收縮末容積顯著增高（P＜0.01），左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、每搏輸出量顯著降低（P＜0.01）。心肌梗死后4周，與心肌梗死組比較，HBO、MSCs、MSCs＋HBO組較AMI組心功能各指標(biāo)均有不同程度改善，其中改善最為顯著者為 MSCs＋ HBO組（P＜0.01），除外舒張末容積變化（P＞0.05）。詳見表1。

表1 干細(xì)胞移植后第4周各組心功能狀況（±s）

表1 干細(xì)胞移植后第4周各組心功能狀況（±s）

指標(biāo) 假手術(shù)組 AMI組（3d） AMI組（4W） HBO組（4W） MSCs組（4W） MSCs＋HBO組（4W）LVSV（mm） 0.64±0.17 0.69±0.18 1.10±0.421） 0.95±0.07 0.80±0.12 0.80±0.241）LVDV（mm） 0.10±0.07 0.19±0.09 0.50±0.041） 0.45±0.02 0.33±0.13 0.17±0.091）LVEF（%） 80.00±10.76 70.98±8.29 58.20±3.011） 58.30±6.79 64.0±11.40 72.96±5.712）FS（%） 43.50±1.56 36.04±6.26 24.60±3.891） 28.70±1.56 31.05±7.84 37.38±4.612）SV（mL） 0.60±0.02 0.47±0.12 0.45±0.061） 0.48±0.14 0.50±0.00 0.67±0.142）與假手術(shù)組，1）P＜0.01；與AMI組（4周）比較，2）P＜0.01。

3 討 論

有效促使干細(xì)胞靶向遷移至受損組織，提高其在受損組織局部的存活率，并能定向分化為功能細(xì)胞，是提高干細(xì)胞移植效率的前提和關(guān)鍵。有學(xué)者將干細(xì)胞比擬為人體真正的“生物組織工程師”，是環(huán)境依賴化的，局部微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的存活、分化起決定性作用[2]。急性心肌梗死早期局部惡劣的缺血缺氧性微環(huán)境是移植干細(xì)胞在心肌受損組織大量死亡的根本原因[3]。氧作為細(xì)胞生存及新陳代謝的重要影響因素，其分壓及濃度對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力具有重要的影響[5]。Peng等[6]在高壓氧預(yù)處理神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，高壓氧處理可逆轉(zhuǎn)缺血缺氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷，增加神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目與活力，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，加速腦損傷的康復(fù)；而單純高濃度氧和高氣壓處理均不能有效地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化，這種增強(qiáng)促進(jìn)不是無限制的，因此不會(huì)導(dǎo)致其他誘導(dǎo)機(jī)制導(dǎo)致的干細(xì)胞成瘤的發(fā)生。高壓氧同樣能夠通過增強(qiáng)干細(xì)胞在梗死心肌組織的存活增殖率，而在干細(xì)胞治療急性心肌梗死有重要協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植后4周，高壓氧輔助干細(xì)胞治療組，干細(xì)胞的存活增殖率較單純干細(xì)胞治療組顯著增強(qiáng)，且心肌組織細(xì)胞心肌鈣蛋白T表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示高壓氧可促進(jìn)干細(xì)胞在梗死心肌組織局部分化為心肌細(xì)胞，分化的心肌細(xì)胞是否有助于梗死后心臟功能改善，本研究結(jié)果顯示，在干細(xì)胞移植4周后，高壓氧輔助干細(xì)胞組除舒張末容積外，其收縮功能、射血分?jǐn)?shù)均顯著改善，這表明高壓氧輔助干細(xì)胞治療心肌梗死能夠顯著改善梗死后心臟功能的恢復(fù)，它應(yīng)是干細(xì)胞治療急性心肌梗死的一項(xiàng)有效的輔助措施。

[1]Atta B，Satsuki Y，Ruben CD，etal.Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction[J].Am Coll Cardiol，2010，56：721－734.

[2]Husnain KH，Muhammad A.Strategies to promote donor cell survival：Combining preconditioning approach with stem cell transplantation[J].J Molecular Cell Cardiology，2008（45）：554－566.

[3]Nicolle K，Gaia S，Silvia A，etal.Targeting stem cell niches and trafficking for cardiovascular therapy[J].Pharmacol Ther，2011，129（1）：62－81.

[4]楊鈺萍，沈祥春，劉興德，等.氧化苦參堿對(duì)急性心肌梗死誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌重塑的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（6）：125.

[5]Tatyana N，Milovanova VM，Bhopale EM，etal.Hyperbaric oxygen stimulates vasculogenic stem cell growth and differentiation in vivo[J].J Appl Physiol 2009（106）：711－728.

[6]Peng ZR，Wang SE，Xiao PT.Effect of hyperbaric oxygen on the differentiation of brain derived neural stem cells[J].J Clin Rehabilitative Tissue Engineering Research，2007，11（3）：427.