從維甲酸信號(hào)途徑探討電針促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的研究1）

陶 靜，洪江從，鄒愉龍，薛偕華，楊珊莉，林志誠，陳立典

缺血性腦損傷時(shí)，產(chǎn)生興奮毒性，引發(fā)腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷甚至死亡［1］。治療的關(guān)鍵在于挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)［2］。重組組織型纖溶酶原激活劑（rt－PA）是唯一經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)能有效治療急性缺血性腦卒中的藥物。rt－PA 治療可發(fā)生嚴(yán)重的致命性顱內(nèi)出血的并發(fā)癥，限制了rt－PA 的應(yīng)用［3］。

近年來研究證實(shí)［4］，人及動(dòng)物成年腦內(nèi)有多處部位存在著自我更新和分化潛能的靜息態(tài)神經(jīng)干細(xì)胞（NSC），可參與修復(fù)缺損的神經(jīng)功能。在成年嚙齒類動(dòng)物和成人腦中有3 個(gè)NSC群［2］，1個(gè)是位于腦室區(qū)和腦室下區(qū)（ventricular zone and subventricular zone，VZ and SVZ），另1個(gè)在連接側(cè)腦室和嗅球的區(qū)域（在成人尚未證實(shí)），第3 個(gè)是在海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）。NSC的增殖分化受多種生長因子和細(xì)胞信使分子的調(diào)控［5］。維甲酸是影響細(xì)胞增殖分化的信號(hào)之一，在脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育中起關(guān)鍵作用［6］。研究表明RA 能夠激發(fā)腦室區(qū)、腦室下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)再生，顯著提高多種干細(xì)胞分化為神經(jīng)元［7－10］。利用維甲酸處理短尾猴胚胎干細(xì)胞成功地獲得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（表達(dá)NFM 和IsletⅠ＋）后植入偏癱模型小鼠，小鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯改善［11］。

針灸治療缺血性腦卒中臨床療效確切，電針足三里、曲池亦可刺激腦室區(qū)、腦室下區(qū)和海馬齒狀回的神經(jīng)增殖、分化，促進(jìn)腦缺血恢復(fù)期神經(jīng)功能的恢復(fù)［12－16］。開展此項(xiàng)研究，以期為針灸的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 Raldh1、Raldh2和β－actin引物（上海生工生物工程有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒、SDS－PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)研究所），Prestained Protein marker（立 陶 宛MBI公 司），PVDF 膜（美國Millipore公司），羊抗Raldh1、羊抗Raldh2（美國Santa Cruz Biotechnoligy公司），鼠抗β－actin、HRP 標(biāo)記抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 儀器 Homecage儀器（美國clever system 公司制造），全自 動(dòng) 酶 標(biāo) 儀（BioTek），PE－9600 PCR 儀（PE 公 司，美 國），Nicon ECLIPSETE2000－U 倒 置 生 物 顯 微 鏡，Cool4500 數(shù) 碼 相機(jī)，電泳儀、微型凝膠電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)、半干電轉(zhuǎn)移槽、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio－Rad公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重250g±30g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：2007000509570。大鼠144只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組，各48只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備 參照Zea－Longa線拴法［17］復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型。頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。

1.3.2 模型篩選 參照Longa和Bederon 的5 分制評(píng)分方法［17，18］評(píng)分。1分～3分入選。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 假手術(shù)組：僅分離CCA、ECA 及ICA，不結(jié)扎、插線。模型組：于缺血再灌后1d、7d、14d、28d各取6只，先進(jìn)行Homecage Scan行為學(xué)檢測，之后取梗死側(cè)腦組織用于Western blot檢測，另取6只梗死側(cè)腦組織用于PCR 檢測。針刺組：穴位取患側(cè)曲池、足三里（大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［19］）。應(yīng)用華佗牌SDZ－Ⅱ型電針治療儀，電壓峰值為6V，以肢體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率（4～20）Hz，每次電針20 min，1次／日。于缺血再灌1d、7d、14d、28d各取6只，先進(jìn)行Homecage Scan行為學(xué)檢測，之后取梗死側(cè)腦組織用于Western blot檢測；另取6只梗死側(cè)腦組織用于PCR 檢測。

1.3.4 觀察指標(biāo) Homecage Scan行為學(xué)檢測：在術(shù)后1d、7 d、14d、28d，將各組大鼠放入Home cage儀器中進(jìn)行觀測24 h。每一段影像由HomecageScan軟件來分析，選取行走、進(jìn)食、后肢站立、舔毛四個(gè)行為進(jìn)行分析。蛋白免疫印跡法（Western blot）：按BCA 蛋白定量試劑盒說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定蛋白含量，計(jì)算出灰度值。RT－PCR檢測：利用RT－PCR 兩步法試劑盒（TaKaRa公司）說明將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析（One－way ANOVA），方差齊者用LSD 法，方差不齊則用Tamhane’s T2法。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)定結(jié)果 假手術(shù)組大鼠各項(xiàng)Homecage Scan行為學(xué)檢測均正常；造模各組大鼠均出現(xiàn)明顯的癱瘓，且隨時(shí)間的推移逐漸恢復(fù)，具體表現(xiàn)為花費(fèi)在行走、后肢站立、舔毛三種行為的時(shí)間逐漸增加，而耗費(fèi)在進(jìn)食上的時(shí)間卻減少；針刺組在術(shù)后7d、14d各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)定與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組進(jìn)食、行走、舔毛、后肢站立時(shí)間比較

2.2 Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 表達(dá)及電針對(duì)其表達(dá)的影響

模型組及針刺組Raldh1mRNA、Raldh2 mRNA 的表達(dá)在術(shù)后第7天升高，第14天達(dá)到高峰，之后表達(dá)減少，至第28天趨于正常。針刺組、模型組第7 天、第14 天Raldh1mRNA、Raldh2mRNA的表達(dá)同假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），針刺組7d、14d的Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 的表達(dá)同模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 的表達(dá)

2.3 Raldh1、Raldh2 蛋白的表達(dá)及電針對(duì)其表達(dá)的影響Raldh1蛋白為一個(gè)55KD 的條帶，Raldh2蛋白為一個(gè)55KD 的雙條帶。研究發(fā)現(xiàn)，Raldh1、Raldh2 蛋白的表達(dá)模式與各自mRNA 的表達(dá)模式相一致，模型組、針刺組第7 天、第14 天Raldh1、Raldh2蛋白的表達(dá)同假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)各組Raldh1、Raldh2蛋白的表達(dá)

3 討 論

腦缺血損傷能激活腦內(nèi)“靜息”的NSC，并促進(jìn)其增殖、遷移和分化，分化的神經(jīng)元能部分地替代和修復(fù)損傷的神經(jīng)元，從而在一定程度上改善缺損的神經(jīng)功能［4］。

維生素A 及其有生物活性的衍生物，特別是維甲酸，在脊椎動(dòng)物發(fā)育、細(xì)胞分化和維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮廣泛的效應(yīng)［20］。體內(nèi)類維生素A 代謝后可產(chǎn)生RA，RA 進(jìn)入細(xì)胞后，首先與細(xì)胞質(zhì)中維甲酸結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)與受體結(jié)合，調(diào)控一系列基因的表達(dá)，誘導(dǎo)海馬及腦室下區(qū)等部位的NSC增殖、分化為神經(jīng)元［6－10］。RA 的生物效應(yīng)主要是由維甲酸受體（RARs和RXRs）介導(dǎo)，通過與RARs和RXRs作用，RA上調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子NeuroD，使P21表達(dá)增加，同時(shí)增加了酪氨酸激酶（tyrosine kinase，Trk）受體TrkA、TrkB、TrkC 和P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的表達(dá)，使NSC向神經(jīng)元分化［21］。RA 還同其他核受體發(fā)生作用，通過與甲狀腺素受體、維生素D3 受體結(jié)合，激活1，25（OH）2D3 及甲狀腺激素的釋放，起到神經(jīng)保護(hù)作用［22，23］。此外，RA 能夠誘導(dǎo)中期因子的表達(dá)，對(duì)缺血性腦損傷起到保護(hù)作用［24］。

維生素A 要通過兩次氧化才能轉(zhuǎn)變?yōu)镽A，首先氧化為視黃醛，然后經(jīng)視黃醛氧化脫氫酶（Raldhs）催化形成RA。Raldhs有三種：Raldh1，Raldh2 和Raldh3。Raldh3 僅在眼睛、面部及腹側(cè)視網(wǎng)膜和端腦神經(jīng)節(jié)隆起有表達(dá)，胚胎發(fā)育成熟后，這種酶在肝臟及皮膚也可被檢測到，Raldh1 主要存在于背側(cè)視網(wǎng)膜、腹側(cè)中腦及中腦到紋狀體的投射纖維，而Raldh2主要存在于腦膜中［25］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組及針刺組Raldh1、2各亞型蛋白及mRNA 的表達(dá)在術(shù)后第7 天升高，第14 天達(dá)到高峰，至第28天趨于正常，針刺組第7、1 4天的Raldh 1、2各亞型蛋白及mRNA 的表達(dá)同模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針可調(diào)控Raldh1、2各亞型蛋白及mRNA 的表達(dá)。

為了定量分析神經(jīng)功能缺損，將缺血性腦卒中大鼠置于HomecageScan系統(tǒng)測試籠中。國外已將該測試系統(tǒng)運(yùn)用到Huntington病、Prion病和腦出血大鼠模型中［26，27］，相比傳統(tǒng)的行為學(xué)檢測而言，Homecage Scan 系統(tǒng)檢測具有以下的優(yōu)勢［28－30］。首先，節(jié)約了大量的人力。其次，能夠全天候地觀測大鼠的行為活動(dòng)。第三，能夠?qū)崟r(shí)反映出動(dòng)物的行為動(dòng)作，避免了傳統(tǒng)的評(píng)測方法中試驗(yàn)人員的人為干擾因素，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取和環(huán)境改變等因素對(duì)治療效果的影響。

Homecage Scan行為學(xué)檢測的數(shù)據(jù)顯示，MCAO 術(shù)后，大鼠舔毛、行走、后肢站立這三種行為所耗費(fèi)的時(shí)間呈現(xiàn)遞增的趨勢，進(jìn)食方面花費(fèi)的時(shí)間在第7 天突然出現(xiàn)增長，而后逐漸遞減。查看相關(guān)錄像資料后發(fā)現(xiàn)：MCAO 術(shù)后第1天，處于創(chuàng)傷期的大鼠很少有進(jìn)食行為；此后數(shù)天，偏癱大鼠在進(jìn)食時(shí)需要耗費(fèi)比平時(shí)多數(shù)倍的時(shí)間才能抓取到食物，在第28天，針刺組、模型組與假手術(shù)組的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，造成這一結(jié)果的原因可能與腦損傷后大鼠的自我修復(fù)有關(guān)，自我修復(fù)主要通過腦水腫的減輕，發(fā)芽，突觸調(diào)整，遠(yuǎn)隔功能抑制等機(jī)制實(shí)現(xiàn)［31］。本研究選用鼠齡（8～12）周SD 大鼠作為MCAO 模型，這與缺血性腦卒中患者多為中老年人的事實(shí)不符，有可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管如此，研究結(jié)果顯示：針刺組在術(shù)后7d、14 d各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)分與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種神經(jīng)功能方面的改善與Raldh1、2各亞型蛋白及mRNA 的表達(dá)上調(diào)是一致的，間接地說明了通過調(diào)控RA 蛋白及其mRNA 的表達(dá)，電針可以改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能表現(xiàn)。

本研究顯示，電針可以改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與調(diào)控RA 信號(hào)途徑有關(guān)，這為電針治療缺血性腦卒中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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