β—catenin蛋白敲除對(duì)肺成纖維細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

張亞娟++++++田新瑞++++++常+++琴++++++王崇剛++++++董艷婷

[摘要] 目的 探討β-catenin蛋白敲除對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞（CCC-REPF-1）活性的影響及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞（CCC-REPF-1），應(yīng)用CCK-8法、Western blot、 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖、活性及功能表達(dá)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。 結(jié)果 TGF-β1刺激組、 pcDNA3轉(zhuǎn)染組CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn 蛋白表達(dá)量、α-SMA 、colⅠ、colⅢmRNA表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞組，而E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯低于正常細(xì)胞組；F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組上述值明顯低于TGF-β1刺激組（P<0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量高于TGF-β1刺激組 （P<0.01）；TGF-β1刺激組、 pcDNA3轉(zhuǎn)染組比較無(wú)明顯差異。 結(jié)論 TGF-β1是促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、活化的重要細(xì)胞因子，β-catenin途徑是TGF-β1 發(fā)揮作用的重要信號(hào)通路，β-catenin蛋白敲除通過(guò)阻斷該信號(hào)途徑，阻止肺纖維化進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] β-catenin；TGF-β1；肺成纖維細(xì)胞；肺纖維化

[中圖分類號(hào)] R563.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）21-0001-04

肺纖維化是呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)展至晚期的共同病理改變，造成肺功能不可逆的損傷，嚴(yán)重危害人類健康[1]。目前研究認(rèn)為，肺纖維化的基本病理過(guò)程包括早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質(zhì)細(xì)胞增生，發(fā)生基質(zhì)膠原的進(jìn)行性積聚以致逐漸取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響肺的通氣和換氣功能[2-3]。在增生的細(xì)胞中，除肺泡上皮細(xì)胞和成肌細(xì)胞等外，成纖維細(xì)胞的增殖及活化并分泌基質(zhì)膠原是纖維化形成的重要機(jī)制[4]。TGF-β1被認(rèn)為是誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化的最重要的細(xì)胞因子[5]，其作用的發(fā)揮與β-catenin途徑高度相關(guān)[6]。本研究通過(guò)觀察β-catenin蛋白敲除對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖及活性的影響，探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細(xì)胞機(jī)制，為肺纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及物品

大鼠肺成纖維細(xì)胞（CCC-REPF-1），pcDNA3.0載體（Invitrogen），F(xiàn)-TrCP-Ecad載體（鄭國(guó)平教授惠贈(zèng)），Lipofectamine2000（Invitrogen），TGF-β1（PeproTech），抗E-cadherin，抗α -SMA，抗Fn（ SantaCruz），F(xiàn)ITC標(biāo)志的羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清（中國(guó)杭州四季青），高糖DMEM培養(yǎng)基（GIBCO），TRIzol總RNA提取試劑（武漢博士德生物工程有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），α-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.2 肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及分組

在體外培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細(xì)胞（CCC-REPF-1），用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%的CO2，37℃人工培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分組，分為正常細(xì)胞組（A組）、TGF-β1刺激組（B組）、pcDNA3轉(zhuǎn)染組（C組）、F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組（D組）。

1.3 pcDNA3及F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染CCC-REPF-1細(xì)胞

提取及純化重組質(zhì)粒DNA，測(cè)DNA 濃度備用。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105 cells/L，接種12孔板中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，棄培液，換無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基800 μL，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。100 μL無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中加入4 ng 質(zhì)粒，混合后置5 min，共6個(gè)EP管，3管為質(zhì)粒pcDNA3，3管為質(zhì)粒F-TrCP-Ecad，100 μL無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中加入 4 μL Lipofectamine2000混合后置 5 min，6個(gè)EP管，將上述復(fù)合物混合后置20 min，棄12孔板6孔的培養(yǎng)基，用無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基清洗2次，加無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，將上述復(fù)合物分別加入 6個(gè)孔，前后晃置4～6 h換正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6 h換新鮮培養(yǎng)基，各組分別加入TGF-β1（5 ng/mL），作用48 h。

1.4 CCK-8法檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5000個(gè)/100 μL， 以每孔100 μL接種于96孔板，每組復(fù)設(shè)8孔，每板每孔加入CCK-8 10 μL，5%CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，分光光度計(jì)下測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處OD值。

1.5 Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA、Fn的表達(dá)

取細(xì)胞用PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管，離心后棄上清，將收集到的細(xì)胞加細(xì)胞裂解液裂解1 h后，離心30 min，取上清，BCA蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白30 μL行SDS-PVDF凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，條件4 ℃ 2～5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h。在4 ℃下小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白單克隆抗體（稀釋為1∶200）與膜接觸孵育過(guò)夜，用洗膜緩沖液（TBST）在脫色搖床下洗膜5 min×5次，加羊抗小鼠IgG，室溫下孵育2 h后，TBST洗膜，加入ECL在室溫下反應(yīng)5 min后成像，Taiphone掃描結(jié)果，采用Gene Snap/Gene Tool軟件分析以GAPDH蛋白為內(nèi)參定量分析E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白條帶相對(duì)灰度值。

1.6 總RNA 抽提及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timePCR）endprint

各組細(xì)胞每孔加入500 μL TRIzol Reagent，按試劑盒說(shuō)明提取總RNA及行RT-PCR檢測(cè)α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參。

GAPDH引物序列：上游引物5ˊ- GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT -3ˊ下游引物5ˊ- CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3，α -SMA上游引物5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ，colⅠ：上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcol Ⅲ：上游引物5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下游引物5ˊ- GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反應(yīng)體系條件： 95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s。40個(gè)循環(huán)。由隨機(jī)附帶軟件計(jì)算出Ct值和拷貝數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 肺成纖維細(xì)胞光鏡下觀察

成纖維細(xì)胞呈梭型，有較長(zhǎng)的突起，胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，成放射狀和柵欄狀排列。TGF-β1刺激后，細(xì)胞體積明顯增大，胞突消失，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞間隙變小。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大部分細(xì)胞呈梭型，有較長(zhǎng)的突起，細(xì)胞間有明顯間隙。見(jiàn)圖1。

A 正常細(xì)胞（倒置相差顯微鏡×200）

B TGF-β1 刺激組（倒置相差顯微鏡×200）

C pcDNA3轉(zhuǎn)染組（倒置相差顯微鏡×200）

D F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組（倒置相差顯微鏡×200）

圖1 肺成纖維細(xì)胞光鏡下觀察（×200）

2.2 CCK-8法觀察各組肺成纖維細(xì)胞增殖

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組其OD值明顯增高，但兩組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組OD值較TGF-β1刺激組明顯減低（P<0.01），與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 CCK-8法測(cè)量各組大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖OD值（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉(zhuǎn)染組比較，dP<0.01

2.3 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA、Fn、E-cadherin的表達(dá)

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組其α -SMA、Fn 蛋白表達(dá)顯著升高， E-cadherin表達(dá)顯著降低（P<0.01），而兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組較TGF-β1刺激組α -SMA、Fn 蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin表達(dá)顯著升高（P<0.01），與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織中α-SMA、Fn 、E-cadherin蛋白表達(dá)（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉(zhuǎn)染組比較，dP<0.01

2.4 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)α-SMA、colⅠ、colⅢ表達(dá)

與正常組比較， TGF-β1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組β-catenin途徑α -SMA，colⅠ，colⅢmRNA表達(dá)增高（P<0.01），而兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組較TGF-β1刺激組α-SMA、colⅠ、colⅢ表達(dá)降低（P<0.01），與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞α-SMA 、colⅠ、col Ⅲ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

（x±s，n=8）

注：與正常組相比，aP<0.01；與F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組相比，bP<0.01；與TGF-β1 刺激組相比，cP<0.01；與pcDNA3轉(zhuǎn)染組比較，dP<0.01

3 討論

肺成纖維細(xì)胞增殖與活性增強(qiáng)是肺纖維化發(fā)生的重要的致病過(guò)程，對(duì)其機(jī)制的研究并尋找新的治療靶點(diǎn)是目前研究的焦點(diǎn)[7]。肺纖維化過(guò)程中在TGF-β1刺激下[8]使肺成纖維細(xì)胞不斷地增殖和轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MB）。MB是一種特殊階段的FB，能夠大量分泌ECM，分泌能力是FB 的4～5倍，大量表達(dá)α-SMA、Fn、I、III型膠原，加速纖維化進(jìn)程。

TGF-β1是誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化發(fā)生的最重要的生長(zhǎng)因子[9]，TGF-β1發(fā)揮作用的途徑包括Smad、β-catenin和非Smad通路，其β-catenin途徑與疾病及纖維化形成的病理過(guò)程高度相關(guān)[8]。Vuga，et al[10]發(fā)現(xiàn)WNT5A基因途徑在IPF的肺成纖維細(xì)胞較正常肺成纖維細(xì)胞有顯著地調(diào)節(jié)意義，通過(guò)非經(jīng)典的WNT/β-catenin途徑[11-13]WNT5A激活顯著地誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。Chilosi等[14]報(bào)道了在特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者受損支氣管基底細(xì)胞和損傷部位肺成纖維細(xì)胞中可見(jiàn)β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移、積聚，提示β-catenin與肺纖維化及肺成纖維細(xì)胞活性的相關(guān)性，因此我們?cè)O(shè)想通過(guò)抑制β-catenin功能可能對(duì)肺纖維化發(fā)揮治療作用。

F-TrCP-Ecad質(zhì)粒是Cong[15]等設(shè)計(jì)的β-catenin靶向降解質(zhì)粒，只降解細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin蛋白，而不破壞細(xì)胞膜上的β-catenin蛋白，從而減少其向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，降低其轉(zhuǎn)錄活性。本研究采用該載體轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞，觀察阻斷β-catenin途徑對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖及活性的影響。結(jié)果顯示：TGF-β1刺激48 h后，成纖維細(xì)胞體積明顯增大，胞突消失，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞間隙變小，F(xiàn)-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大部分細(xì)胞呈梭型，有較長(zhǎng)的突起，細(xì)胞間有明顯間隙。CCK-8法檢測(cè)F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組肺成纖維細(xì)胞增殖較TGF-β1刺激組明顯降低。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α -SMA、Fn蛋白表達(dá)量明顯低于TGF-β1刺激組，E-cadherin表達(dá)量較TGF-β1刺激組增高。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大鼠肺成纖維細(xì)胞β-catenin途徑轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物α-SMA、colⅠ、colⅢ表達(dá)明顯降低，證實(shí)β-catenin蛋白敲除通過(guò)降解細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin蛋白，減少其向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖、活性增強(qiáng)，抑制纖維化進(jìn)程。endprint

綜上所述，TGF-β1是促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、活化的重要細(xì)胞因子，β-catenin途徑是TGF-β1 發(fā)揮作用的重要信號(hào)通路，β-catenin蛋白敲除載體（F-TrCP-Ecad質(zhì)粒）通過(guò)阻斷該信號(hào)途徑，阻斷成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為其活性形式肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞釋放胞外基質(zhì)，阻斷纖維化進(jìn)程，從而能為肺纖維化疾病治療提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-04-01）endprint